责编 | 逸云
细胞是生物体结构和功能的基本单位.为了细胞中各种生物化学反应的快速高效完成，细胞进化出了一系列的细胞器，包括有膜包裹的（比如线粒体，细胞核，溶酶体等）和无膜包裹的细胞器（核仁等）。有膜包裹的细胞器将特定蛋白、核酸等物质包裹起来，以在特定的空间内执行其功能.这些无膜细胞器没有细胞膜包裹，但是仍能稳定存在，并与周围环境产生频繁的分子交换。无膜细胞器如何形成以及其物理化学本质，是困扰了大家多年的问题。而相分离（liquid–liquid phase separation, LLPS）提供了一个形成此类细胞器的机制：某些蛋白质或者核酸分子可以通过多价相互作用，在原本均一的环境中产生物理化学性质不同的另一相，形成无膜细胞器或者是细胞结构。在绝大多数情况下，这些细胞结构呈现液态特征，所以被称为液滴（liquid droplet）或者是液态凝聚体（liquid condensates）。
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liquid–liquid phase separation
近年来，相分离领域已经成为生命科学领域研究的大热点。生物学中很多不能解释的过程，可能都会被这种自组装的方式调控。相分离在生物体内多种方面都发挥作用，比如基因表达调控、细胞分裂以及胁迫响应等等。最近两年，有关相分离在植物中的研究也取得了一系列重要进展，研究成果大都发表在CNS主刊上。为方便研究人员查阅，我们把相关工作做了以下汇总：
2020年8月，英国剑桥大学Philip Wigge团队在Nature在线发表了一篇题为A prion-like domain in ELF3 functions as a thermosensor in Arabidopsis的研究论文。该研究发现拟南芥ELF3通过PrD（prion-like domain）介导的相变感受环境温度变化，使ELF3成为一个新的热感受器。
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ELF3的PrD区域含有polyQ（polyglutamine）重复序列。研究发现polyQ重复序列的长度与热响应性相关。二穗短柄草（Brachypodium distachyon）的ELF3（BdELF3）缺少PrD区域，能够回补拟南芥elf3突变体在正常温度（22 °C）下的表型，但是却不能回补在高温（27 °C）下提早开花的表型。这说明，PrD对于ELF3在温度反应中起关键作用。以前的研究发现，酵母中含有PrD蛋白会发生相分离现象：蛋白溶液具有类似油水混合物的凝集相和稀释相。对拟南芥ELF3进行了体内和体外分析发现，ELF3蛋白也显示出了温度相关的相分离现象：在低温下，ELF3在细胞内弥散分布；当温度升高时，ELF3聚集成点状；当温度再次下降，这些斑点会恢复到弥散状态。而BdELF3在相同条件下没有发生相分离，说明ELF3的相分离取决于PrD的存在。总之，PrD介导的ELF3相分离能够感知环境温度变化，这是一种全新的温度感知机制。
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A mechanism that enables plants to respond to high temperatures
论文链接：
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2644-7
2020年3月，中国科学院植物研究所/河南大学生命科学学院张立新教授研究团队在Cell 发表了题为Liquid-Liquid Phase Transition Drives Intra-chloroplast Cargo Sorting的研究论文，首次提出并阐明了相分离驱动叶绿体内蛋白分选的新机制。该研究发现了位于叶绿体基质的关键蛋白转运分选因子STT1与STT2，阐明了双精氨酸依赖转运途径的底物识别、分选以及转运靶定到双精氨酸依赖转运途径的分子机制。
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STT1与STT2蛋白都包含N端的IDR (intrinsically disordered region) 结构域与C端的ankyrin repeat结构域。STT1与STT2能够依赖于ankyrin repeat结构域的相互作用形成一个椭圆球状异源二聚体结构，而STT1与STT2的IDR区域分别含有保守的WEEPD基序与LVP-W基序，负责识别底物信号肽的双精氨酸（RR）基序与疏水结构域（H domain）。研究表明，底物结合后会激活STT复合物进一步组装相分离形成浓缩的液滴。STT-底物相分离液滴协助底物穿过叶绿体基质从而靶定到类囊体膜。而Hcf106能够抑制STT的相分离从而释放底物，完成底物的正确运输与装配。这种方式可能既能确保底物折叠，同时保持底物信号肽的活性便于被下游Tatc/Hcf106通道识别。阻碍STT-Hcf106结合会阻断Tat底物的运输，影响植物光合作用从而导致植物致死的表型。该研究提出并阐明了相分离驱动叶绿体内蛋白分选的新机制，推动了蛋白转运机理的进一步深入，揭示了相分离的重要生理意义，而且对于探讨叶绿体的生物发生、光合器官的建成和功能调节以及真核生物的起源和进化等都具有重要的意义。
Model for STT-Mediated Substrate Protein Delivery to the CpTat Translocon through Liquid-Liquid Phase Separationhttps://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.0452019年5月，英国 John Innes Centre的Caroline Dean研究组与清华大学李丕龙研究组合作在Nature发表题为Arabidopsis FLL2 promotes liquid-liquid phase separation of polyadenylation complexes 的研究论文。该研究发现拟南芥coiled-coil蛋白FLL2介导RNA 3’末端加工因子的相分离，从而促进特定基因的3’末端形成。在该研究中，研究人员首先发现调节拟南芥开花的关键蛋白FCA能够形成nuclear bodies。有意思的是，FCA蛋白含有prion-like结构域且大部分区域高度无序，这是大部分能够发生相分离的蛋白所共有的两个特征。这一发现让研究人员猜测FCA能够发生液-液相分离从而形成nuclear bodies。体内实验结果证明了这一猜测：FCA形成的nuclear bodies具有液滴的性质。体外重组的FCA prion-like结构域很容易发生相分离形成液滴，然而全长FCA蛋白却不能，暗示在细胞内FCA的相分离还需要其它因子的帮助。为了探究这一现象，研究人员利用正向遗传筛选发现coiled coil蛋白FLL2是FCA发挥功能所必须的。有意思的是，FLL2与FCA共定位于nuclear bodies中。进一步研究发现，fll2突变体中FCA 几乎不能形成nuclear body，而过表达FLL2能够明显使FCA形成的nuclear body增大增多，说明FLL2能够在体内帮助FCA发生相分离形成nuclear bodies。基于以上结果，研究人员认为FCA通过液-液相分离形成nuclear bodies，这些亚细胞结构能够富集3’末端加工因子，从而促进特定RNA的3’末端加工。该研究揭示了RNA3’末端加工的新机制，并首次发现coiled coil蛋白在液-液相分离中起重要作用，加深了我们对相分离机制的理解。A working model for the role of the coiled-coil protein FLL2 to promote nuclear bodies that are important for polyadenylation at specific siteshttps://doi.org/10.1038/s41586-019-1165-82019年2月，宾夕法尼亚大学Alison M. Sweeney研究组在Cell 上发表题为Pollen Cell Wall Patterns Form from Modulated Phases 的研究论文。该研究根据花粉表面多糖中可能存在的非稳态的相分离特性对于不同植物花粉表面的多样性进行分析，建立了一个统一的物理学模型。为了探究初生外壁在花粉表面模式形成的作用以及该过程中是否存在相分离的现象，作者首先找到了一个合适的植物模型：西番莲（Passiflora incarnata），之所以选择西番莲因为其花藤数量丰富并且花粉发育的各个时期连续且容易观察。作者将西番莲的花粉发育过程分为六个阶段：第一阶段，减数分裂之后初生外壁形成之前；第二阶段初生外壁开始形成；第三阶段，初生外壁变得不均一；第四阶段，初生外壁不均一性增加，花粉细胞膜形态开始波动；第五阶段，初生外壁形成达到发育完全的阶段，初生外壁与细胞膜之间产生明显的界限，几何形状变得规则；第六阶段，花粉外壁以及表面模式形成完全。其中第五阶段中最初是不均一形态的初生外壁形成两层空间上分离的密度不同的层，对于作者提出的初生外壁随着花粉细胞的成熟发生相分离的理论提供了强有力的证明。为了确认初生外壁中存在的相分离在花粉初生外壁模式形成中的作用，研究组将此生物学过程模拟成为一个物理学的相变过程。研究发现花粉初生外壁的模式形成过程中，相分离达到稳态之前会进入一个动力学阻滞（Kinetic arrest）阶段，并且根据此模型对现存的部分植物进行分类后发现，能够处于此种动力学阻滞过程中的植物，在进化过程中花粉初生外壁模式形成过程更不保守，进化过程更快。该研究在微米以及纳米尺度上对于花粉发育过程给出了一个有效的可能存在的机制。此工作中提出的框架也可能为一些其他的表面结构例如细胞壁以及昆虫角质层形成模型模拟提供参考。Pollen Cell Wall Patterns Form from Modulated Phaseshttps://doi.org/10.1016/j.cell.2019.01.0142018年1月，德国马普生化所Manajit Hayer-Hartl课题组在Nature杂志在线发表了题为Rubisco condensate formation by CcmM in β-carboxysome biogenesis 的研究论文，报导了Rubisco-CcmM复合物结构，并且通过生理实验验证了Rubisco在β-羧酶体生物发生过程中由CcmM介导的相变过程的分子机制。![]()
该研究首先从解析了蓝细菌Synechococcus elongatus中CcmM的SSUL1的晶体结构，分辨率为1.65 Å。SSUL1与此前报导的RbcS结构同源，但是序列不同源。并且，此结构是氧化状态下的结构，可以看到Cys261和Cys279之间的二硫键。同时，他们也解析了还原状态下的SSUL1结构，分辨率为1.2 Å，除了没有二硫键，其他与氧化状态下一致。通过生化实验，他们发现Rubisco和M35按一定比例（1:8）混合会变浑浊，形成聚集网络，并且验证该复合物是有功能的。但同时也发现，不管是单独的SSUL，还是M13-1，M13-2 或M13-3，都不能形成该网络；只有M24-1/2（SSUL1 and SSUL2）组合才能介导Rubisco网络形成。接着他们发现Rubisco-M35的网络动态特性表明这些蛋白质经历了液-液相分离（Liquid–liquid phase separation, LLPS）。通过荧光实验，将Rubisco和M35red按一定比例组合，可诱导分层成圆形荧光冷凝物，平均Feret直径为约1.3 μm，符合液滴的特征，确定是LLPS。与Rubisco在绿藻类淀粉核（pyrenoid）中的行为类似，在更具活力的氧化条件下，M35可将Rubisco浓缩成液体基质，与羧酶体中的状态一致。研究发现，在晶体结构中看到的SSUL中的二硫键对于羧酶体的生物学功能很重要，它增加了基质网络的灵活性，并且是体内羧基体功能所必需的。突变掉相关的Cys会导致羧酶体对CO2的需求增加约10至20倍，倍增的时间增加约2至2.5倍。为了解M35-Rubisco相互作用的分子基础，他们通过cryo-EM和单粒子分析解析到了复合物结构。他们在Rubisco“赤道”附近发现了额外的电子密度，通过结构修正，解析了2.77 Å完整的Rubisco–SSUL复合物结构。结构显示4个SSUL模块结合一个Rubisco，与RbcL二聚体和RbcS之间的界面通过盐桥、范德华力等作用力互作。同时，他们发现SSUL与RbcS的互作对此前发现的Rubisco网络的形成非常重要。因此，Rubisco的液体状缩合物的形成是通过与SSUL结构域的动态相互作用介导的，而不是通过低复杂性序列介导的。Cryo-EM structure of Rubisco–M35 complexeshttps://doi.org/10.1038/s41586-019-0880-5