Nat Protocols | 陈亮/付向东合作组报道R-loop的新测序技术
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当新生RNA与模板DNA通过碱基互补配对形成杂合链时，另外一条非模板DNA链将处于单链状态，由此形成的三链核酸结构称为R-loop。R-loop广泛存在于细菌、真菌、植物与动物的基因组中，并具有广泛的生物学意义。现已知R-loop在基因转录、DNA复制、表观遗传修饰以及DNA损伤修复等过程中都具有重要作用，是具有调控功能的核酸结构【1】，而R-loop的水平紊乱则常会导致转录与复制失调以及基因组稳定性下降，并由此促进许多重大疾病的发生和发展。随着对R-loop重要生物学意义的逐渐揭示，近年来对R-loop研究的关注也在迅速上升。
图片引自：https://en.wikipedia.org/wiki/DRIP-seq
R-loop研究非常依赖能够准确定位与定量R-loop结构的检测技术。早期研究主要依赖电镜、点杂交和免疫荧光等传统手段。这些方法可以对R-loop的强度和细胞定位做出整体分析，但对单个R-loop结构在基因组的位置与水平却无法评判。2012年美国加州大学戴维斯分校的Frederic Chedin课题组利用识别RNA/DNA杂合链的单克隆抗体S9.6和ChIP技术开发了体外富集R-loop的高通量测序技术DRIP-seq，将R-loop研究带入到基因组学时代【2】。
利用DRIP-seq，研究者们总结了R-loop在基因组的位置偏好性与核酸序列特征，并发现了许多参与R-loop 调控的蛋白因子。这极大促进了R-loop生物学的研究进程。然而，DRIP-seq及其改进方法也存在若干技术问题，包括检测信号的分辨率有限和S9.6抗体的特异性不足。此外，体外富集的DRIP-seq信号能否真实反映细胞内R-loop的水平仍存在争议。这些问题的解决亟待不依赖S9.6抗体的新测序技术的开发。
近日，来自武汉大学生命科学学院的陈亮研究员与美国加州大学圣地亚哥分校（UCSD）的付向东教授在Nature Protocols期刊联合发表论文 R-ChIP for Genome-wide Mapping of R-loops by Using Catalytically Inactive RNASEH1，详细描述了一种可对体内R-loop进行准确定位与定量的新测序技术，命名为R-ChIP。
现已知在哺乳动物细胞中表达两种核酸内切酶，RNASEH1和RNASEH2，可特异性切割R-loop结构中的RNA部分。R-ChIP通过在细胞中表达外源RNASEH1突变体（对其催化位点进行突变，但保留R-loop的结合活性）可特异性识别体内形成的R-loop，再经过ChIP富集和链特异性测序文库的建立，即可绘制细胞内R-loop的全基因组图谱（下图）。该方法具有三个特点:
1)高分辨率,R-ChIP运用超声而非限制性内切酶实现染色质的片段化，因此R-ChIP鉴定的R-loop区域可达到200个碱基而非几千个碱基的精度；
2）链特异性,即使对双向转录区的R-loop信号，R-ChIP也可以准确识别R-loop的方向。
3）高特异性,与一般的ChIP-seq不同，研究者可以使用RNASEH1催化/结合位点双突变体的R-ChIP数据做为阴性对照，进一步提高R-loop识别信号的特异性。
R-loop是转录的产物，但并不是所有活跃转录的基因或区域都会产生R-loop，那么促进R-loop生成的因素包括什么呢？作者在此前的工作中利用R-ChIP技术对R-loop的动态变化进行监测，发现RNA聚合酶的停滞是促进R-loop形成的重要原因【3】。此外，转录区域DNA的GC分布以及非模板链形成的二级结构对R-loop的形成也具有重要影响，这与之前报道一致【2】。在研究R-loop与重大疾病的关系时，作者运用R-ChIP技术发现在骨髓增生异常综合症（MDS）中，多种剪接因子的突变均造成造血干细胞R-loop水平的紊乱，从而影响基因组的稳定性与细胞功能维持【4】，提示R-loop异常可能是MDS疾病发生的共同机制，为MDS与白血病的研究和治疗提供了全新视角。
事实上，R-ChIP与之前的DRIP-seq及其衍生技术所展示的R-loop全基因组图谱并不十分相像。主要区别在于：
1）R-ChIP捕获到到的R-loop信号集中在活跃转录基因的TSS区，而DRIP-seq和DRIPc-seq则显示R-loop信号在TSS下游1-2kb的位置最为富集；
2）R-ChIP数据显示R-loop的大小在200bp左右，而DRIP等方法检测到的R-loop信号常常延绵若干kb；
3）R-ChIP很少在基因末端捕获到R-loop信号，而DRIP等方法则显示许多基因末端存在R-loop。
这就引发了一个很值得深入研究的问题：是R-ChIP技术无法捕获到基因组中所有的R-loop，还是DRIP-和DRIPc-seq技术的存在特异性问题？有意思的是，美国康奈尔大学的Samie Jaffrey课题组近期在DRIP-seq的基础上结合bisulfite conversion（识别R-loop中的非模板单链区域）开发了bisDRIP-seq，以提高DRIP-seq分辨率【5】。数据比较结果显示，相对于DRIP-seq/DRIPc-seq，bisDRIP-seq与R-ChIP的信号分布更为接近（下图）。
由于目前对于R-loop的检测并无所谓“金标准”，因此两种方法的优缺点还有待未来研究加以判别，这也是领域内很多研究者所感兴趣的方向之一。就像很多其他科学问题一样，关于R-loop的研究也许同样需要在不同论点的辩证求真过程中不断前进。
据悉，本文的第一作者是美国加州大学圣地亚哥分校医学院的陈加余博士，通讯作者是美国加州大学圣地亚哥分校医学院的付向东教授和武汉大学生命科学学院的陈亮教授。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41596-019-0154-6
制版人：子阳
参考文献
1. Crossley, M.P., Bocek, M., and Cimprich, K.A. (2019). R-Loops as Cellular Regulators and Genomic Threats. Mol Cell 73, 398-411.
2. Ginno, P.A., Lott, P.L., Christensen, H.C., Korf, I., and Chedin, F. (2012). R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Mol Cell 45, 814-825.
3. Chen, L., Chen, J.Y., Zhang, X., Gu, Y., Xiao, R., Shao, C., Tang, P., Qian, H., Luo, D., Li, H., et al. (2017). R-ChIP Using Inactive RNase H Reveals Dynamic Coupling of R-loops with Transcriptional Pausing at Gene Promoters. Mol Cell 68, 745-757 e745.
4. Chen, L., Chen, J.Y., Huang, Y.J., Gu, Y., Qiu, J., Qian, H., Shao, C., Zhang, X., Hu, J., Li, H., et al. (2018). The Augmented R-Loop Is a Unifying Mechanism for Myelodysplastic Syndromes Induced by High-Risk Splicing Factor Mutations. Mol Cell 69, 412-425 e416.
5. Dumelie, J.G., and Jaffrey, S.R. (2017). Defining the location of promoter-associated R-loops at near-nucleotide resolution using bisDRIP-seq. Elife 6.
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