Cell | 可行，可靠，可视化：新型移植性肿瘤斑马鱼模型的建立

来源：BioArt

移植性肿瘤动物模型已被广泛运用于肿瘤生长和转移机制研究，抗肿瘤药物筛选和新药评估等领域【1】。目前，近亲繁殖的同系小鼠和免疫缺陷型小鼠都是成熟的移植性肿瘤动物模型【2】。但小鼠模型也存在不足，例如小鼠的饲养成本较高，需要的饲养空间较大；并且小鼠的皮毛阻碍了在体肿瘤细胞的成像。因此，一些研究者将注意力转向将斑马鱼作为移植性肿瘤动物模型。

斑马鱼作为研究模型具有很多优点：斑马鱼与人类基因同源性高达85%，其信号传导通路与人类基本近似；生殖能力强，生殖方式为体外受精，方便大量筛选；饲养成本低，为小鼠的十分之一到百分之一；个体小，幼鱼体长为1-2mm；透明，方便进行观察；遗传操作系统成熟，敲降，敲除，转基因技术都可实现【3】。

尽管多种移植肿瘤已在斑马鱼模型上建立，包括T、B细胞白血病，急性骨髓性白血病，黑色素瘤，神经细胞瘤等，但斑马鱼作为移植性肿瘤的模型仍有很大的局限。比如，斑马鱼的培养温度一般低于34℃，影响肿瘤细胞的生长；斑马鱼免疫系统在胚胎发育的第21天完全成熟，限制实验时间；而斑马鱼胚胎只允许注射25-100个肿瘤细胞，阻碍了长期移植肿瘤实验的进行【4】。因此，肿瘤移植斑马鱼模型需要进一步改进。

2019年4月25日，来自马萨诸塞州综合医院研究所的David M.Langenau团队在Cell上发表了肿瘤移植斑马鱼模型的最新研究成果 Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish 。文章中，作者使用免疫系统缺陷的斑马鱼，建立并评估了37℃培养条件下的肿瘤移植斑马鱼模型。利用该模型，研究人员从单细胞水平考察了横纹肌瘤的增殖和迁移情况，可视化地检测了联用奥拉帕尼（olaparib）和替莫唑胺（temozolomide）治疗横纹肌瘤的效果，最终为临床前阶段肿瘤治疗提供新的可靠的模型。

敲除斑马鱼的基因prkdc (protein kinase DNA-activated catalytic polypeptide) 及il2rga (interleukin-2 receptor gamma a）（prkdc-/-,il2rg-/-），会造成T、B细胞和自然杀伤（Nature killer, NK） 细胞的缺陷【5】。作者饲养该品系斑马鱼生长2至3个月，更换至含有抗生素的37℃的水中进行培养直到6个月，在这段时间内建立肿瘤移植模型。作者移植了16中不同的肿瘤细胞，包括黑色素瘤，肾细胞癌，慢性髓系白血病细胞，套细胞淋巴瘤等一系列恶性肿瘤，都获得较高的移植率，并且肿瘤细胞都存在超过28天，受体斑马鱼的死亡率小于15%。作者还从组织病理学和细胞形态学角度评估了移植后的肿瘤细胞，证明与肿瘤移植金标准NSG小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1WjI/SzJ）模型相比，移植到斑马鱼体内的肿瘤细胞在标记基因的表达，生长速率和凋亡水平都相似（图1）。

图1：人胚胎横纹肌瘤在肿瘤移植斑马鱼和NSG小鼠模型的生长，病理和凋亡情况。

作者还成功地移植了6种病人来源的肿瘤，建立了病人肿瘤细胞的移植模型，从而使临床前阶段检测治疗方案的效果变得可行，为实现肿瘤病人的个性化治疗奠定了基础。

肿瘤细胞的高度异质性促使研究者在单细胞水平研究肿瘤的生长、转移和治疗抵抗。作者将横纹肌瘤细胞移植到斑马鱼的眼周肌肉，并标记可光转换的H2b-Dendra2蛋白，通过追踪发现横纹肌瘤细胞可分为三种：高度迁移性细胞，增殖性细胞和静息性细胞，并且增殖性细胞能单向转化为高度迁移性细胞，证明移植性肿瘤斑马鱼模型可进行肿瘤单细胞水平的研究。

为将肿瘤移植斑马鱼建立成为临床前治疗模型，作者检测了联用PARP（poly-ADP-ribose polymerase）抑制剂奥拉帕尼和诱导DNA损伤的替莫唑胺对治疗横纹肌肉瘤的效果，结果发现在斑马鱼模型中，单独使用一种药物不具有明显的治疗效果，但二者联用则明显的抑制了肿瘤的生长。而在NSG模型中也出现相同的效应，也说明了斑马鱼作为肿瘤治疗模型的可靠性。

进一步，作者在肿瘤移植斑马鱼模型中，使用不同颜色的荧光蛋白标记细胞周期，发现联用奥拉帕尼和替莫唑胺将横纹肌肉瘤细胞抑制在G2期，为鉴定药物治疗肿瘤的机制指明了方向。

综上，作者建立了新的肿瘤移植斑马鱼模型，能够可靠的重现多种病人来源的肿瘤生长，转移和凋亡情况。斑马鱼通体透明的特点决定该模型能方便使用荧光标记进行肿瘤研究。并且，作者将斑马鱼模型用于临床前治疗效果的检测，为肿瘤病人的个性化治疗奠定基础（图2）。

图2

文章通讯作者为David M.Langenau副教授，其实验室长期致力于移植性肿瘤的斑马鱼模型研究。第一作者为实验室成员Chuan Yan, Dalton C. Brunson，Qin Tang和Daniel Do。

 Langenau实验室成员合影