深度解析Nature长文 | 单细胞尺度描绘肿瘤发生与组织发育对应关系

撰文 | 伊凯

责编 | 兮

脑肿瘤在最常见的各类小儿癌症中位居第二，占全部小儿恶性肿瘤的约20％，仅次于白血病【1】。小儿脑肿瘤最常发生在颅后窝（posterior fossa）尤其是小脑（cerebellum）中，常见的三类分别是髓母细胞瘤（medulloblastoma）、室管膜瘤（ependymoma）和毛细胞型星形细胞瘤（pilocytic astrocytoma）。原发性肿瘤（primary tumor）的产生与机体组织的异常发育往往存在千丝万缕的联系，这一特点在小儿脑肿瘤研究中体现得尤为明显；研究发现不同亚型的小儿小脑肿瘤的发生与小脑组织的特定发育路径具有相同或类似的分子信号通路【2,3】。因此，进一步在细胞亚群乃至单细胞水平上厘清小儿小脑肿瘤的细胞起源和发展路径将极大地帮助我们理解其高度异质化的发生机制，并针对性地开发靶向治疗方案。

2019年5月2日，加拿大多伦多大学附属病童医院（The Hospital for Sick Children）的Michael Taylor、Ontario癌症研究所（OICR）的Lincoln Stein与魁北克麦吉尔大学（McGill University）的Nada Jabodo联合在Nature上发表了题为Childhood cerebellar tumors mirror conserved fetal transcriptional programs的研究论文，结合单细胞测序和基于去卷积的转录组相似性度量方法，为小儿小脑肿瘤的不同分子亚型标定了其在小脑发育过程中对应的细胞亚群，从而为肿瘤的细胞来源和演进路径提供了丰富的线索。

研究人员在胚胎期和出生后的九个不同发育时间节点分别提取了正常小鼠的小脑组织，对合并后的六万两千多个单细胞进行了RNA测序。随后，研究人员利用t-SNE（t-distributed stochastic neighbor embedding，一种非线性数据降维方法）对单细胞基因表达数据进行了降维处理并映射至二维平面内，发现不同发育节点对应的细胞群之间能够较好地区分开（下图左）；同时，当利用已知的小鼠小脑不同细胞群的标志基因的表达量对细胞进行聚类分析时，也能得到相当显著的区分效果（下图右）。这一结果表明，由单细胞RNA测序获得的转录组图谱具有足够高的精度以对正常小鼠小脑发育过程中的高度异质化的细胞亚群进行区分。

在基于单细胞RNA测序成功聚类小脑发育亚细胞群的基础上，研究人员进一步利用不同细胞亚群之间的基因差异表达进行了拟时间轨迹分析（pseudo-time trajectory），推测了细胞亚群之间的演进路径。如下图所示，多个已知的小脑细胞发育过程成功得到重现，这一结果从细胞亚群的相对发育关系的角度证实了单细胞RNA测序对小鼠小脑细胞特征和状态的准确标定。

有了第一部分对单细胞RNA测序数据可利用性的证实，研究人员接下来试图将不同分子亚型的人类小儿小脑肿瘤的大体（bulk，又译混池）RNA测序结果与小鼠小脑的每个细胞发育亚群的基因表达谱进行相似性测量。这一步骤使用的主要分析方法是由Newman和Liu等人于2015年发表在Nature Methods上的基于支持向量机（support vector machine，SVM，一种依据二次规划得出全局最优解的二元分类器）的对大体RNA测序数据进行去卷积（de-convolution）从而推测样本中不同种类细胞的相对比例的生物信息学工具——CIBERSORT【4】。具体而言，研究人员首先用由单细胞RNA测序获得的正常小鼠小脑发育过程中不同细胞类群对应的转录组图谱为相应细胞群做特征标定，随后选取在小鼠和人之间具有高度保守性的基因作为标定靶点，再将由大体RNA测序得到的每一病人肿瘤样本对应的转录组图谱与标定好的细胞群进行相似性度量，从而找到与某一亚型的小儿小脑肿瘤在基因表达上最为接近的正常小脑发育过程中的细胞群。例如，研究人员发现SHH型髓母细胞瘤与颗粒细胞前体（granule cell precursor）在基因表达上最为接近，而这一结果符合这两者已知的直接关联（下图）。

由于相当多的小脑细胞亚群仅存在于特定的发育时间段内，因此从时间维度测量不同分子亚群的小儿小脑肿瘤与某一发育细胞群的相似度也变得十分必要。利用类似前述的方法，研究人员比较了小脑肿瘤样本的表达谱与某一特定发育路径中的不同时间节点的细胞群的表达谱的相似性，结果发现肿瘤往往只与处于某个特定时间节点内的发育细胞群较为相似。例如，PFA型室管膜瘤的基因表达特征与小鼠胚胎期第16天（E16）的胶质前体细胞群最为接近（下图）。

到目前为止，研究人员已经在单细胞水平上描绘出了精细的小儿小脑肿瘤与小脑发育细胞群对应关系，然而，由于肿瘤组织本身亦存在相当程度的异质性，而前述结果也展示了属于同一分子亚群的不同样本在最为接近的发育细胞亚群上亦有不小差异，因此从单细胞水平对这一对应关系进行更深入的研究将有利于阐释肿瘤组织中多样化的细胞来源和发育网络。出于这一考虑，研究人员对十数个人类小儿小脑肿瘤样本进行了单细胞RNA测序并使用t-SNE做了细胞聚类分析，发现同一样本中确实存在基因差异化表达的细胞亚群。接着，研究者对样本中的每个细胞亚群重复了前述的转录组相似性测量分析，因而解析了同一类小脑肿瘤中存在的对应于小脑发育不同阶段细胞群的异质组分。例如，研究人员发现，3型（group 3）髓母细胞瘤的亚群1、2接近于单极刷细胞前体（unipolar brush cell progenitor）而亚群5则更接近颗粒细胞前体。

值得注意的是，尽管该项研究利用高维度的单细胞转录组图谱为不同分子亚型的小儿小脑肿瘤进行了细胞类型的标定，但这并不意味着一类肿瘤一定是由与其在基因表达上极为接近的一类发育细胞亚群所演变而来，这是因为：

 1）机体脑部的发育过程不是仅由干细胞的单向分化构成，其中事实上存在着相当程度的去分化（de-differentiation）和转分化（transformation）等引起细胞状态剧烈改变的事件，因此仅凭转录组的相似性并不足以推导出发育路径的直接关联；

2）基因表达谱所包含的信息不足以唯一地确定细胞状态，对细胞身份的更精细的标定需要同时考虑多组学测序信息。关于第一个问题，进一步的细胞谱系追踪（lineage tracing）的实验证据将会是一个很好的解决方向；而对于第二个问题，方兴未艾的单细胞水平的多组学测序技术【5-7】将不断提高对细胞状态标定的精度。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1158-7

1.Whelan, K. & Alva, E. Epidemiology of Childhood Cancer. in Pediatric Cancer Genetics (2017). doi:10.1016/B978-0-323-48555-5.00001-6

2.Kho, A. T. et al. Conserved mechanisms across development and tumorigenesis revealed by a mouse development perspective of human cancers. Genes Dev. (2004). doi:10.1101/gad.1182504

3.Hatten, M. E. & Roussel, M. F. Development and cancer of the cerebellum. Trends in Neurosciences (2011). doi:10.1016/j.tins.2011.01.002

4.Newman, A. M. et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat. Methods 12, 453–457 (2015).

5.Zhu, P. et al. Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos. Nat. Genet. (2018). doi:10.1038/s41588-017-0007-6

6.Buenrostro, J. D. et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature 523, 486–490 (2015).

7.Rotem, A. et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat. Biotechnol. 33, 1165–1172 (2015).

制版人：子阳

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