Immunity | 短暂或持续？CD8 T细胞基因表达模式的决定机制

撰文 | 立里

责编 | 兮

细胞能够通过调控基因表达应答外界因素的刺激，当环境刺激消失时，一部分基因表达恢复到正常水平，另一部分则维持变化的状态【1】。而这在CD8 T细胞应答病毒感染时表现的尤为明显。T细胞被激活后发生一系列的变化，寿命延长，促炎和细胞杀伤能力增强，迁移性发生改变。在病毒被清除后，效应T细胞逐渐减少，留下小部分记忆性T细胞。这些记忆性T细胞丧失了大部分效应T细胞的功能，但部分功能也被保留下来【2】。但在T细胞中决定基因短暂表达或持续表达的机制尚不清楚。顺式调控是基因表达调控中的一种重要模式，是指染色体上DNA序列直接调控其邻近基因的表达，它主要通过与转录因子结合发挥调控作用【3】。因此，了解顺式调控在T细胞免疫应答过程中的功能并鉴定参与的转录因子对于理解T细胞的基因表达调控至关重要。

2019年4月23日，霍华休斯医学研究所纪念斯隆-凯特琳癌症中心的 Alexander Y. Rudensky团队在Immunity发表文章Natural Genetic Variation RevealsKey Features of Epigenetic and Transcriptional Memory in Virus-Specific CD8 T Cells。文章中，作者巧妙地设计了一系列实验并进行组学分析，发现染色质重塑程度是决定T细胞中基因短暂表达还是持续表达的主要机制。并且，T-box和Runx家族转录因子在染色质重塑过程中发挥广泛的协同调控作用，从而揭示了免疫应答过程中，CD8 T细胞顺式调控基因表达的普遍性机制。

由于直接缺失转录因子会导致一系列直接或间接的基因表达变化，并且转录因子间的冗余和竞争都增加了结果分析的复杂性，所以作者舍弃了这一传统的研究基因表达的方法，转而使用自然产生的小鼠近交系Cast/Eij和Spret/Eij分别与C57BL/6小鼠进行杂交，通过检测了F1代杂合子中等位基因表达不平衡（Allelic expression imbalance, AEI）的情况，来分析基因表达调控。这样，既可以引入Cast/Eij或Spret/Eij与C57BL/6基因组上存在差异的数千万个基因的突变，又同时排除了反式作用的效应。作者使用淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（lymphocyticchoriomeningitis virus, LCMV）感染F1杂合小鼠，在感染后的第7天和8-10周，分离抗原特异性的效应T细胞和记忆性T细胞并进行RNA-seq和ATAC-seq（Transposase-AccessibleChromatin using sequencing）的分析，通过与未感染小鼠的Naive T细胞比较，发现上千个免疫和转录过程相关的基因发生了AEI（图1），其中超过70%具有细胞状态的特异性，说明顺式调控在T细胞基因表达过程中发挥了功能。

图1：免疫和转录相关基因的不平衡表达。

接着，作者对顺势调控功能的重要性进行了鉴定。为排除了天然免疫细胞和MHC限制性的影响，作者分离亲代C57BL/6（CD45.1）和Cast/Eijde（CD45-）的骨髓干细胞，混合后移植到清除骨髓的F1代杂合子（CD45.2）体内，并在病毒感染后检测基因型为C57BL/6和Cast/Eijde的T细胞的基因表达情况，发现二者差异表达的基因有76%能够被表达出现AEI的F1代杂合子中的基因重现，说明差异表达基因有76%受到顺式作用的调控（图2），从而证明顺式作用在基因表达调控过程中发挥主要作用。

图2：C57BL/6和Cast/Eijde的T细胞的基因表达差异与F1代杂合子等位基因表达不平衡的重现性。

通过单细胞转录组分析，作者发现群体水平基因表达发生变化是由于全部个体的基因表达发生变化，而不是由于群体中表达基因的个体数目增多。并且单细胞分析还表明，短暂性的基因表达发生在细胞个体内基因表达的变化和恢复，并不是细胞亚群组成和数目的动态变化导致，这为鉴定基因短暂表达或者持续表达的广泛性机制奠定了基础。

进一步，作者比较了短暂表达和持续表达基因的ATAC-seq的数据，发现持续性表达往往伴随着更剧烈的染色质重塑程度。通过分析造成表达变化的差异基因序列，作者鉴定了调控不同表达模式的转录因子（图3）。其中，RunX和T-box家族在调控基因持续性表达时可能发挥重要作用。

图3：转录因子结合序列对基因表达的影响。

而RunX和T-box家族调控基因表达的机制是作者下一步的研究目标。CD8 T细胞中表达的T-box家族因子只有两个：T-bet和Eomes【4】。染色质免疫共沉淀测序分析（chromatin immunoprecipitationsequencing, ChIP-seq）发现T-bet和Eomes结合区域发生广泛重叠，说明二者的功能存在冗余。同时，作者还发现T-bet和Eomes结合区域中RunX结合序列也存在富集。尽管T细胞中存在多个RunX家族成员（Runx1, Runx2, and Runx3），但该家族有共同的辅助因子CBF-β。ChIP-seq实验也表明60%的CBF-β调控靶标也受到T-bet和Eomes的控制（图4），并且结合ATAC-seq分析，发现T-box和RunX转录因子的靶标大多伴有染色质重塑的发生，co-IP实验也表明T-bet与Runx1存在不依赖于DNA的相互作用，因此，作者认为在CD8 T细胞活化的过程中，转录因子家族T-box和RunX能够协同调控染色质重塑，进而控制基因表达。

图4：T-bet和Eomes结合区域与CBF-β结合区域的重叠性。

综上所述，作者通过检测不同品系小鼠杂交F1代的等位基因表达不平衡，发现CD8 T细胞中决定基因短暂表达还是持续性表达的关键在于染色质重塑的程度，并鉴定了T-box和RunX家族转录因子协同调控持续性基因表达这一广泛性机制（图5）。

图5

本文通讯作者为来自霍华休斯医学研究所的Alexander Y. Rudensky研究员，他在调节性T细胞（regulatory T cells）及转录因子Foxp3领域中作出了突出贡献【5】。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2019.03.031

制版人：子阳

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2. WilliamsMA,Bevan MJ. Effector and memory CTLdifferentiation [J]. Annu Rev Immunol, 2007. 25: 171-192

3. DavidsonEH, The regulatory genome: generegulatory networks in development and evolution. 2010: Elsevier.

4. Banerjee A,Gordon SM, Intlekofer AM, et al. Cutting edge: The transcription factoreomesodermin enables CD8+ T cells to compete for the memory cell niche [J]. J Immunol,2010. 185(9): 4988-4992

5. FontenotJD, Gavin MA,Rudensky AY. Foxp3 programs thedevelopment and function of CD4+CD25+ regulatory T cells [J]. Nat Immunol,2003. 4(4): 330-336

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