近日,复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系暨代谢分子医学教育部重点实验室甘肖箐课题组在骨钙素调控能量代谢方面取得重要进展,揭示了TCF7/TCF1反馈控制棕色脂肪细胞中的骨钙素信号转导独立于Wnt/β-Catenin信号途径。相关研究成果于2018年1月22日以《T细胞因子(TCF7)/TCF1反馈控制棕色脂肪细胞中的骨钙素信号转导与Wnt/β-Catenin信号通路无关》(T Cell Factor 7 (TCF7)/TCF1 Feedback Controls Osteocalcin Signaling in Brown Adipocytes Independent of the Wnt/β-Catenin Pathway)在线发表于《Molecular And Cellular Biology》杂志。
如今人们生活水平不断提高,饮食健康和作息时间越发不规律,生活压力越来越大,导致患糖尿病、心血管疾病、癌症等代谢性疾病的人群激增。而关于糖、脂代谢方面的调节一直是生物医学方面的研究热点。脂肪组织作为重要的能量代谢器官,受多种信号途径的控制,包括骨钙素和经典Wnt/β-catenin信号通路。
研究背景:骨骼不但在运动、保护器官以及维持钙磷稳态等方面发挥重要功能,还作为一种分泌器官合成并分泌骨钙素。骨钙素可以作用于胰腺、脂肪、肌肉,睾丸,大脑等器官,参与动物体内能量代谢、雄性生殖、大脑发育等生理过程。给正常小鼠持续注射重组骨钙素蛋白,小鼠胰腺中β细胞增多,胰岛素分泌增加,脂联素(Adiponectit)表达增加,小鼠的体重、脂肪垫质量降低,血浆中三酞甘油水平也降低。此外,给小鼠间歇注射未羧化的骨钙素能增加其骨骼中线粒体的数量,增强能量代谢,抵制肥胖。因此,本研究旨在证明骨钙素在脂肪组织中的能量调节的分子机理,为糖尿病等代谢疾病提供新的治疗靶点有重要意义。
研究思路:骨钙素的靶器官受体GPRC6A是一种新型G蛋白偶联受体,分布于胰腺、脂肪、肠道、骨等组织中,与多种配体结合发挥作用,并参与机体糖稳态调节。骨钙素与脂肪细胞表面的GPRC6A受体结合后,GPRC6A的胞外区能够识别骨钙素C端的保守序列,通过影响脂联素间接改善胰岛素敏感性。T细胞因子7(TCF7)是tcf/lef 1家族中对经典Wnt/β-catenin通路起关键作用的DNA结合因子,而TCF 7可以调节Gprc6a和UCP 1启动子的激活,这一过程与β-catenin转录因子无关,但TCF7的活性与热发生辅激活剂PRDM16和组蛋白脱甲基酶LSD 1关联。本实验通过胶原酶消化法,从C57BL/6J小鼠中分离出附睾白色脂肪和肩胛棕色脂肪的脂肪源性基质细胞(ADSCs)于培养基中培养,提取组织材料中的总RNA进行定量分析,并在HEK293T细胞中进行免疫共沉淀,使用LeicaSP5显微镜采集免疫荧光图像,记录实验结果并进行数据分析。
研究结果:为了验证骨钙素刺激棕色脂肪细胞的热生成,实验首先以载体肽VC为对照,将人骨钙素(OCN)和小鼠骨钙素(ocn)在HEK293T细胞中过表达48h,在条件培养液中获得扩散的骨钙素后用Westernblotting进行验证,随后以纯化的谷胱甘肽S-转移酶 (GST)蛋白为标准样,用蛋白质A/G-Plus凝胶浓缩纯化后进行了考马斯亮蓝染色,测定载体肽、Ocn和OCN的浓度,再从附着的白色脂肪组织 (Wat) 或肩状棕色脂肪组织 (Bat) 中分离出原发性脂肪间质细胞进行脂肪生成,C2C12细胞经骨钙素预处理2天后进行脂肪和肌肉生成。在成熟阶段 (第3天-第5天) 进行骨钙素刺激后进行PCR定量分析并测定mRNA含量,对比发现与 Wats-adsc 衍生的白色脂肪细胞相比, Bat-adscc 衍生的棕色脂肪细胞在热原基因中的表达水平更强,而热发生过程中的核心分子ucp 1的表达量的增加说明棕色脂肪细胞中骨钙素具有潜在的热调节作用。骨钙素还能促进Myf 5+肌样前体的棕色脂肪样分化。
接下来作者为了验证骨钙素信号转导所涉及的受体和转录因子,在未分化或脂原 BAT-ADSC、DE-2-3、WAT-ADSC和C3H10T1/2细胞中,检测骨钙素刺激Gprc6a 2天后的Gprc6a mRNA水平,与空白组进行对比,发现骨钙素刺激后Gprc6a mRNA水平升高,说明骨钙素可以激活Gprc6a受体的活性。
随后,作者对骨钙素和Wnt/β-catenin信号通路的对脂肪细胞热产生的交互作用进行讨论,通过检查Seden小鼠或4周自由跑(Run)的小鼠皮下腹股沟白色脂肪库 (iWAT) 和肩周棕色脂肪组织 (BAT) 中Ucp1、Lef1、Tcf7、Tcf7l1和Tcf7l2、Ptprv、Fndc5的 mRNA 水平,与骨钙素刺激后的Ucp1、Lef1、Tcf7、Tcf7l1等基因的mRNA水平进行对比,发现其表达量有所上升,得出TCF7 可调节过骨钙素信号转导,Gprc6a 基因的过度表达也会使Tcf7基因激活。而Axin2 基因的转录是典型的Wnt/β-catenin途径的一个特定靶点, 它可以被骨钙素激活, 但会被 Wnt3a 拮抗剂 DKKK1 抑制,从而证明了骨钙素信号和典型Wnt/β-catenin途径之间的交互作用。而骨钙素通过调节Tcf7和Wnt3a基因的转录表达参与Wnt/β-catenin信号调控。
为了进一步证明Tcf 7直接调控ucp 1和gprc6a启动子的激活,本实验对DE-2-3和BAT-ADSC衍生棕色脂肪细胞中Ucp1 和 Gprc6a的mRNA表达水平进行测定,随后敲除TCF7基因,对其表达含量测定,发现Tcf7 基因的过度表达并没有改变脂滴的形成和 Pparg 基因的表达, 但明显提高了 UCP1 蛋白含量, 并促进了热原基因的激活,Tcf7的敲除明显阻断了 de-2-3 衍生和 Bat-adsc 衍生的棕色脂肪细胞中骨钙素诱导的 Ucp1 和 Gprc6a 转录, 证明了TCF7 在骨钙素信号转导中的下游调控作用。
最后推测出TCF7介导的骨钙素信号转导反馈控制模型如下:即骨钙素在棕色脂肪细胞中通过激活特定的基因程序(Utp1, Dio2, Pgc-1α,Prdm16)来增强总能量消耗进而调节棕色脂肪细胞的代谢作用,TCF 7可能通过依赖PRDM 16和LSD 1协同作用于整个信号途径来调控骨钙素在棕色脂肪族中中色基因转录,LSD1参与TCF7/PRDM16 介导的转录机制,转录控制Wnt3a和TCF7,TCF7介导的骨钙素信号转导与Wnt/β-catenin信号途径交互作用,但TCF7可以直接促进Gprc6a和Ucp1启动子的激活,而这一过程与β-catenin信号途径无关。
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