Mol Cell背靠背丨分子伴侣精密调节p53构象及活性变化

撰文 | 陈皮

责编 | 兮

肿瘤抑制因子p53是一种序列特异性转录因子，在细胞命运调控中发挥着重要作用【1】。p53的功能结构域包括：N端反式激活结构域，DNA结合结构域（p53-DBD, DNA binding domain），富含脯氨酸结构域，四聚体结构域，C端调控结构域。在超过50%以上的人类肿瘤中均发现了在p53-DBD上的突变，对p53-DBD的生化和结构分析表明p53是以动态且不稳定的形式存在于体内【2】。

Hsp90是一种非常重要的ATP-依赖分子伴侣，在体内发挥着激活和稳定许多调节蛋白的作用。Hsp70作为另一种热休克蛋白，其主要作用则是稳定蛋白质的展开或部分折叠状态。Hsp70可以阻止未折叠蛋白的聚集，或者帮助转移到下游的伴侣蛋白，如Hsp90。因此，Hsp70和Hsp90在体内协同作用，与其他辅助分子伴侣协作，促进蛋白质的成熟【3】。

早先的研究表明，野生型p53和突变型p53均与Hsp90存在着相互作用。在正常生理条件下，野生型的p53 与HSP90 分子伴侣复合物仅有短暂的相互作用以维持p53 活性并介导其通过泛素化进行降解。当p53 发生突变，构象会发生变化，其细胞周期检验点活性受到破坏。在肿瘤细胞中，p53 与HSP90 分子伴侣复合物进行异常相互作用并且持续时间延长，进而抑制p53 蛋白的降解，因此会在细胞内积累了大量失去抑癌功能的p53 蛋白【4】。部分体外试验表明，在室温下（25℃），p53不需要分子伴侣的帮助就能维持DNA结合活性，但在生理和热休克温度下需要Hsp90才能维持活性稳定【5】。在细胞中，Hsp90和Hsp70在热休克下协同作用增强，维持p53活性。目前的研究证实，在正常和应激条件下，Hsp70和Hsp90对保持p53在应激下的活性很重要【6】。

然而，p53与Hsp70和Hsp90分子伴侣复合体的相互作用机制仍是未解之谜。

近日，Molecular Cell杂志在线背靠背发表了来自慕尼黑整合蛋白科学中心（CIPSM, Center for Integrated Protein Science Munich）Johannes Buchner团队与Don C. Lamb团队和德国海德堡大学分子生物学中心（ZMBH）Matthias P. Mayer团队的两项研究成果。两篇文章通过不同的研究手段揭示了相同的结论，即分子伴侣Hsp70和Hsp90对p53构象和活性调节起着相反作用。下面将主要解读Johannes Buchner团队与Don C. Lamb团队合作发表的题为Coordinated Conformational Processing of the Tumor Suppressor Protein p53 by the HSP70 and Hsp90 Chaperone Machineries的文章。

在文章中，研究者发现作为分子伴侣，HSP70-HSP40在生理温度下可通过解折叠p53使其失活，而HSP90和HOP（HSP70/90 organizing protein，HOP）则在ATP水解后将p53折叠成天然构象。揭示了不同的分子伴侣复合物对p53构象在时空上的严格调控从而调节p53结合DNA的活性。

研究者首先采用荧光各向异性法检测分子伴侣存在与否是否会影响p53-DBD与DNA的结合能力。在反应体系中含有Cy5标记的p21 DNA的情况下，于37℃添加Hsp70-Hsp40和ATP后可观察到DNA与p53-DBD的分离，而在25℃下并不能观察类似的现象。接着，研究者利用荧光标记p53-DBD*,结合各向异性和分析超离心法监测Hsp70与p53-DBD结合，发现在体外同时添加Hsp40和ATP能显著增强p53-DBD*与Hsp70的结合作用。有趣的是， Hsp40可与p53-DBD结合并且它们的亲和力与Hsp70-Hsp40与p53-DBD*相类似。这些结果表明，在37℃下，Hsp40与p53-DBD形成复合物并启动它与Hsp70的结合，Hsp70-Hsp40 ATP-依赖的联合作用进一步导致p53-DBD的DNA结合活性丧失。

接着，研究者针对什么原因造成生理温度下p53-DBD的DNA结合活力被完全抑制做出了推测，他们认为这是由于p53-DBD与Hsp70-Hsp40复合体的形成阻碍了DNA的空间结合或者是分子伴侣捕获了解折叠的p53使得其无法结合DNA造成的。针对前者，研究者通过光散射实验观察反应体系中p53-DBD的聚集情况，发现虽然p53-DBD本身或者在Hsp70-Hsp40和ATP存在的条件下并不会发生聚集。针对后者，研究者利用单对荧光共振能量转移（spFRET）试验结合多参数荧光检测和脉冲交错激发试验（MED-PIE）分析了Hsp70-40诱导的p53-DBD去折叠过程。结果表明生理温度下，HSP70-Hsp40和ATP的共同作用导致p53-DBD蛋白构象向去折叠状态转换，去折叠的p53-DBD蛋白构象不稳定继而导致细胞内p53活性丧失。

与Hsp70-Hsp40复合体功能相反，过往研究表明，Hsp90在体内对维持p53的稳定发挥着重要作用。那么Hsp90是否能拯救去折叠的p53-DBD活性丧失？因Hop负责同时结合Hsp70和Hsp90促进蛋白从Hsp70向Hsp90转移，基于此，研究者向已形成Hsp70-Hsp40-p53-DBD复合体的反应体系中添加Hop和/或Hsp90，发现加入了Hop和Hsp90后p53-DBD恢复了50%的DNA结合活力。并且，对Hsp90的功能抑制包括外源添加Hsp90抑制剂radicicol（结合Hsp90上的核苷酸结合pocket）或是添加apyrase（一种能快速水解ATP的酶）破坏ATP持续水解，均会影响p53-DBD对DNA的结合能力。

但是，Hop和Hsp90起始p53-DBD再活化反应过程中存在滞后阶段，研究者推断p53-DBD未能有效的从Hsp70-Hsp40复合物中释放可能是原因所在。因Bag-1（核苷酸交换因子, NEF）可以调节Hsp70与p53的相互作用，研究者继而发现Bag-1可作为Hsp70的NEF促进转移中间体Hsp70-40-p53-DBD-Hop-Hsp90的分离，并释放p53-DBD。进一步的结果表明，Bag-1从Hsp70中释放的p53-DBD构象不同于从Hsp90中直接释放的p53-DBD构象，而Bag-1与Hop-Hsp90协作促进p53-DBD重新恢复到折叠态构象。

最后，研究者采用全长p53（p53-FL）来验证在p53-DBD上发现的生理相关性结果。相似的，在37℃下，Hsp70-40和ATP的存在会使p53-FL失去DNA结合活性。在25℃回补Hop和Hsp90可以回复25%的DNA结合活性，当然，Hsp90的ATPase活性的维持对p53-FL再活力依然很关键。不同的是，对于p53-FL而言，辅助分子伴侣p23而非Bag-1扮演了从Hsp70-40-Hop-Hsp90复合体释放去折叠态p53-FL的角色，从而恢复其DNA结合能力。

总的来说，本研究通过体外实验重现p53与分子伴侣系统（Hsp70和Hsp90）的相互作用，阐述了在生理条件下，Hsp70和Hsp90以ATP依赖的方式持续不断地调控p53的构象变化。（图1）

图1

在海德堡大学分子生物学中心（ZMBH）Matthias P. Mayer团队发表的题为Hsp70- and Hsp90-Mediated Regulation of the Conformation of p53 DNA Binding Domain and p53 Cancer Variants的研究长文中，研究者通过结合氢交换质谱法（Hydrogen exchange mass spectrometry, HX-MS）和生化手段描述了p53-DBD-WT及癌症中出现的热点突变型在生理温度下由分子伴侣调节的构象平衡过程。Hsp70（HSPA1A）/Hdj1（DNAJB1）以ATP依赖的方式增强p53-DBD的去折叠化。Hsp70/Hdj1通过结合DNA binding loop使p53从DNA上脱离。与之相对的，Hsp90通过减少p53-DBD上β-sanwich结构中心的氢交换从而稳定p53-DBD蛋白构象。（图2）

图2

两篇文章提出的观点表明，Hsp70和Hsp90对p53构象和活性的反向调节在细胞环境中是有益的，通过分子伴侣机制循环，p53不断地发生重构，其活性状态与细胞的应激状态相联系，使得p53能够对细胞环境的变化做出快速应答，以防止细胞在极端环境下发生的不可逆变性。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.03.026

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.03.032

制版人：子阳

1. Kastenhuber, E.R., and Lowe, S.W. (2017). Putting p53 in Context. Cell 170, 1062–1078.

2. Hainaut, P., Rolley, N., Davies, M., and Milner, J. (1995). Modulation by copper of p53 conformation and sequence-specific DNA binding: role for Cu(II)/Cu(I) redox mechanism. Oncogene 10, 27-32.

3. Echtenkamp, F.J., and Freeman, B.C. (2012). Expanding the cellular molecular chaperone network through the ubiquitous cochaperones. Biochim. Biophys. Acta 1823, 668–673.

4. Muller, P., Hrstka, R., Coomber, D., Lane, D.P., and Vojtesek, B. (2008). Chaperone-dependent stabilization and degradation of p53 mutants. Oncogene 27, 3371–3383.

5. Muller, L., Schaupp, A., Walerych, D., Wegele, H., and Buchner, J. (2004). Hsp90 regulates the activity of wild type p53 under physiological and elevated temperatures. J. Biol. Chem. 279, 48846–48854.

6. Walerych, D., Gutkowska, M., Klejman, M.P., Wawrzynow, B., Tracz, Z., Wiech, M., Zylicz, M., and Zylicz, A. (2010). ATP binding to Hsp90 is sufficient for effective chaperoning of p53 protein. J. Biol. Chem. 285, 32020–32028.

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