怎么验证一堆 mir 的靶基因？
前言：
大家在前期调研中是否经常遇到这些问题：
通过各种在线软件进行预测获得 miRNA 靶向基因，但对 miRNA 靶基因的实际作用不清楚。
预测到转录因子对基因的表达起抑制或增强的作用，而具体活性以及结合位点仍然需验证。
未知 lncRNA 或者 circRNA 吸附 miRNA 效果。
这个时候就需要用到萤光素酶（Luciferase）实验了。
什么是萤光素酶？
萤光素（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是来自萤火虫体内 (Firefly) 和海肾 (Renilla) 体内的两类萤光素酶，分别命名为 F-Luciferase 和 R-Luciferase。
萤光素酶可以催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在 luciferin 氧化的过程中，会发出生物荧光（bioluminescence），可通过荧光测定仪设备测定 luciferin 在氧化过程中释放的生物荧光，常应用于启动子转录活性调控及 miRNA 靶基因验证等方向的研究。
萤光素酶的两个应用：
简单了解了萤光素酶，我们再介绍下它的两个应用。
（一）：pGL3-Basic——用于转录因子结合位点与启动子活性分析。
当我们把待分析的启动子区段构建到 F-Luciferase 上游，和转录因子共转染分析 F-Luciferase 活性即可反应启动子的活性高低。该质粒通常需要结合持续性表达 R-Luciferase 的载体作为内参以校正不同样品之间转染的转染效率。
启动子的作用相当于「基因开关」，能够控制基因表达的起始。而启动子的活性受转录因子的调节，转录因子是一种具有调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。一些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的 DNA 结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。萤光素酶报告基因分析（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。
将靶启动子的特定片段插入到报告基因质粒中萤光素酶编码序列的 5』端，再与转录因子表达质粒共转染细胞，加入特定的萤光素酶底物，通过检测荧光的强度可以测定萤光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。结合定点突变等方法则可进一步确定转录因子与靶标启动子的作用。
（二）psiCHECK2——用于 miRNA 与其靶点相关分析
包括 miRNA 靶基因验证、lncRNA 与 circRNA 吸附 miRNA 验证等。需要把 miRNA 潜在结合靶点克隆到 R-Luciferase (hRLuc) 3』UTR 区域，然后与待测 miRNA 共同转染细胞内测定 R-Luciferase 活性高低，F-Luciferase（hLuc+）作为校正内参和不同样品之间转染的转染效率。
miRNA 通常功能性作用于靶基因 3'UTR，因此可以将目的基因 mRNA3'UTR 序列插入载体 R-Luciferase (hRLuc) 3'UTR 区域， 通过比较 miRNA 引起的 R-Luciferase 活性高低来定量检测 miRNA 对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法则可进一步确定 miRNA 对靶基因 3'UTR 的直接靶向序列。
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文章来源：汉恒生物
题图来源：站酷海洛