氢氘交换质谱揭示A型β-内酰胺酶与其抑制蛋白结合的关键变构位点

来源：X一MOL资讯

β-内酰胺类抗生素是当下抗细菌感染最为常用的药物，而病菌耐药性很大程度上限制了使用此类药物的应用。病原菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药的主要原因是通过产生β-内酰胺酶，从而水解β-内酰胺环而使药物失去疗效。根据氨基酸序列和结构的差异可将β-内酰胺酶分为ABCD四种类型，其中A型β-内酰胺酶是临床上较为常见的类型之一，包括TEM型、SHV型和OXA型等。TEM型和SHV型分布最广，其数量已达上百种。有些突变体甚至对β-内酰胺酶抑制剂，比如克拉维酸，产生显著的耐药性。因此，临床上亟需新型的抑制剂来应对这一问题。β-内酰胺酶抑制蛋白（BLIP）由棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）产生，能够对某些β-内酰胺酶产生显著的抑制效果。虽然其结合的模式非常相似，但BLIP针对不同亚型β-内酰胺酶的抑制活性有很大差异。因此，研究BLIP与A型β-内酰胺酶的相互作用可以增进对这类抑制作用的理解，从而启发设计新型的酶抑制剂。
最近香港理工大学的姚钟平团队利用氢氘交换质谱（HDX-MS）结合原态离子迁移质谱（native IM-MS）以及分子动态模拟（MD simulation）研究了A型β-内酰胺酶与其抑制蛋白的相互作用。氢氘交换法可用于观察生理条件下蛋白分子主链上酰胺氢与溶液中氘代水的交换反应，同时质谱可灵敏且准确地捕捉交换的程度。交换速率主要受蛋白分子上的氢键和溶剂可及性影响，从而反映蛋白主链的动态构象。
该研究首先揭示了在天然状态下不同亚型的A型β-内酰胺酶（TEM1、SHV1和PC1）在几个主要的结构域存在显著的动态构象差异，其中包括位于结合界面的protruding loop和外围的H10区域，也包括位于催化部位的SDN loop和Ω loop（图1）。而这些差异在晶体结构上并没有得到显著的体现。当这些β-内酰胺酶与BLIP相结合而处于抑制状态下，TEM1整体表现出显著的构象变化（图2）。值得注意的是，TEM1的protruding loop表现出更加刚性的动态构象，相反地，SHV1和PC1的protruding loop则更加柔性。由此可反映SHV1 和PC1与BLIP在这个结构域的作用不如TEM1与BLIP紧凑。另外，H10区域在三种β-内酰胺酶中均表现出更加紧凑的动态构象。结合分子动态模拟的结果，推测该区域可能是一个可调节β-内酰胺酶和BLIP结合的别构部位。

图1. A型β-内酰胺酶与其抑制蛋白的结合模型

图2. TEM1 型β-内酰胺酶与BLIP结合前后氢氘交换水平的变化
为进一步验证上述发现，该研究引入三个BLIP突变体（Y50A、E73M和K74G），可分别对TEM1、SHV1以及PC1产生显著增强的抑制作用。对比HDX-MS 的结果发现，Y50A对TEM1在protruding loop动态构象的抑制作用更加显著，反映Y50A与TEM1在该区域更强的结合。而E73M对SHV1在该区域的作用虽然没有表现出显著的抑制作用，但相比野生型，表现出更加刚性的动态构象。K74G对PC1在该区域的影响也十分相似。有趣的是，E73M和K74G分别对SHV1和PC1 的H10区域的动态构象均表现出显著的抑制作用。
综上所述，该研究不仅揭示了A型β-内酰胺酶与抑制蛋白结合界面的动态结构变化，更提示了H10区域作为一个可调节β-内酰胺酶抑制作用的别构部位。该发现可为新型β-内酰胺酶抑制的研发提供重要线索。
这一成果近期刊登在J. Am. Chem. Soc. 上，文章的第一作者是香港理工大学博士研究生黄丽文。