史上第一个哺乳动物线粒体NAD+转运蛋白学术资讯

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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）及其还原形式（NADH）在维持几乎所有生物的细胞代谢和细胞存活中起着至关重要作用。NAD+作为电子受体，在脂肪酸氧化、三羧酸循环等不同代谢途径之间传递能量，同时，NAD+是糖酵解和线粒体呼吸过程中所必须的，NAD+的缺乏将无法产生ATP。此外，当释放到细胞外环境时，NAD+也是多种信号酶的底物，包括去乙酰化酶（sirtuins）、ADP核糖转移酶和循环ADP核糖合成酶等，可以调节各种细胞信号通路【1,2】。毫不夸张的说，细胞内NAD+含量的细微变化就会影响细胞的行为，而完全的缺乏则是致命的。

线粒体中NAD+的含量对于维持重要的细胞功能尤其重要，百年来针对NAD+的研究有一大部分都集中在线粒体基质中的NAD+依赖过程。尽管研究发现一些真菌和植物中的线粒体NAD+是通过载体蛋白从细胞质导入的，但是这些转运体在哺乳动物中都没有同源物，介导NAD+进入哺乳动物线粒体的转运体至今尚未发现，哺乳动物线粒体到底是如何获得其所需的NAD+的量的问题从未得到过解答。虽然研究发现线粒体烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶（NMNAT3）可以在体外催化NAD+的生物合成，也有研究表明线粒体内可能拥有一个完整的通路促进烟酰胺直接合成NAD+，但是研究证实这并不是哺乳动物线粒体NAD+来源的普遍机制【3,4】。似乎哺乳动物的线粒体也存在着某种转运体，可以将胞质中的NAD+运输进线粒体，但是是谁肩负着这一重任呢？

2020年9月9日，来自美国宾夕法尼亚大学的Joseph A. Baur团队在Nature上在线发表文章“SLC25A51 is a mammalian mitochondrial NAD+ transporter”，首次发现哺乳动物细胞中肩负着线粒体中完整NAD+转运重任的转运蛋白——SLC25A51。

故事的开始似乎并不复杂。作为线粒体载体家族的一员，SLC25A51早已被多个全基因组筛选研究确定为一个必需基因，但是却一直没有人赋予其功能，因此，成为本文研究人员的候选基因。

首先，第一个问题在于SLC25A51是否在线粒体NAD+稳态中发挥作用呢？研究人员利用多个不同的shRNA和siRNA序列在人类细胞系中进行敲低实验，或用CRISPR敲除细胞中的SLC25A51，都发现SLC25A51对于维持线粒体NAD+的水平是必须，但是不影响细胞内的NAD+总量。而过表达SLC25A51则足以增加线粒体内游离NAD+的水平，与过表达酵母线粒体NAD+转运体NDT1所产生的影响类似。利用两种不同的线粒体靶向NAD+生物传感器也能检测出同样的结果。与此同时，代谢组学分析显示，线粒体提取物中只有NAD+、NADH和NAD+衍生代谢物循环ADP核糖发生了显著变化，相比之下，整体细胞提取物中的NAD+和NADH水平并没有变化。由此证实，SLC25A51的缺失将导致线粒体组分中NAD+的选择性缺失。

进一步地实验发现，SLC25A51缺陷或缺失的细胞中，其线粒体的基础呼吸和最大呼吸能力，以及依赖于复合体Ⅰ的呼吸都受损。这种情况下，简单的补充内源性NAD+并不足以挽救细胞的线粒体呼吸，只有低剂量的腺病毒感染以限量过表达SLC25A51时才能使其恢复。但与呼吸能力相比，线粒体膜电位在SLC25A51缺失后保持不变。可见SLC25A51的表达对于细胞呼吸有着深远的影响。

那么，SLC25A51是否介导了哺乳动物线粒体对NAD+的摄取呢？当把提取分离出来的线粒体与内源性NAD+一起孵育时，正常细胞的线粒体基质中的NAD+含量增加，但是SLC25A51缺陷细胞的线粒体基质中的NAD+含量没有变化，只有在重新表达了SLC25A51后线粒体才恢复对内源性NAD+的摄取。同样的，过表达SLC25A51足以增加分离线粒体对内源性NAD+的摄取。此外，研究人员发现，酵母线粒体NAD+转运体NDT1也可以挽救SLC25A51缺陷细胞的线粒体NAD+的重新摄取。同样的，SLC25A51的过表达可以使缺失了内源性NAD+转运蛋白的酵母线粒体恢复对NAD+的摄取。由此表明线粒体摄取NAD+的能力依赖于SLC25A51或具有NAD+转运蛋白活性的蛋白的表达。

为了进一步研究SLC25A51介导完整细胞内线粒体NAD+转运的能力，研究人员利用了一种线粒体靶向聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（mitoPARPcd）载体，该报告系统基于线粒体NAD+的持续消耗及其对聚ADP核糖（PAR）自我修饰的偏好，PAR的稳态水平可以反映线粒体摄取NAD+的能力。结果表明，过表达SLC25A51可以显著提高mitoPARPcd报告系统的信号。同样地，由于烟酸核苷（NaR）可以通过胞质酶NAD+合成酶转化为NAD+，研究人员用同位素标记烟酸和核糖以监测胞浆中合成的NAD+含量，结果发现NaR可以增加野生型细胞中线粒体内NAD+的含量，但对SLC25A51缺失细胞则无影响；在两类细胞中，整体细胞内NAD+的标记程度类似，但大部分标记的NAD+只在野生型细胞中进入了线粒体，而SLC25A51缺失细胞中没有进入。

综上所述，本文首次发现SLC25A51及其同源物SLC25A52可以介导哺乳动物线粒体对NAD+的摄取，并且证实SLC25A51是维持人类细胞中正常线粒体NAD+水平所必需的。尽管目前尚不能排除线粒体NAD+摄取的其他可能机制，但是SLC25A51在多个细胞系中的特征表明，直接由SLC25A51介导的摄取是哺乳动物线粒体NAD+摄取的主要机制。

参考文献：

1. Amit Singhal, Catherine Youting Cheng. Host NAD+ metabolism and infections: therapeutic implications. Int Immunol. 2019, 15;31(2):59-67.

2. V A Kulikova, D V Gromyko, A A Nikiforov. The Regulatory Role of NAD in Human and Animal Cells. Biochemistry (Mosc). 2018, 83(7):800-812.

3. Yang, H. et al. Nutrient-sensitive mitochondrial NAD+ levels dictate cell survival. Cell 130, 1095-1107, (2007).

4. Pittelli, M. et al. Inhibition of nicotinamide phosphoribosyltransferase: cellular bioenergetics reveals a mitochondrial insensitive NAD pool. J Biol Chem 285, 34106-34114, doi:M110.136739 [pii] https://doi.org/10.1074/jbc.M110.136739 (2010).

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