『珍藏版』Nature 综述 | 细胞命运决定中的转录因子与基因组三维构象

撰文 | 伊凯

责编 | 兮

图片引自：https://www.cell.com/fulltext/S0092-8674(11)00588-5

细胞状态与命运的决定机制一直是生物学领域中的一个基本问题。对这一问题的深入理解不仅有利于认识细胞分化和发育的普遍规律，也对于剖析包括发育畸形和癌症在内的疾病的发生机制具有深远的意义。一般认为，细胞状态是由细胞的表现型和功能特征来表征的，且最终由特定的基因表达程序来决定。具体而言，细胞通过对外界环境信号产生响应而激活相关信号转导通路，使特定转录因子发挥功能，经由对基因表达程序进行特异调控而决定细胞命运。尽管这一思路长期以来被应用至简单的线性DNA调控模型中，近年来染色质三维折叠研究技术的进步则使基因组三维构象（3D genome conformation）成为了转录调控中不可忽视的关键因素。因而，一个更加完整的以基因转录为核心的细胞状态决定机制应该同时包括转录因子、表观遗传修饰和基因组三维构象等多层次的调节因素（下图）。

2019年5月16日，Nature刊登了题为Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions 的综述，详细探讨了基因转录和基因组构象之间的相互作用如何成为细胞命运决定的驱动力。现BioArt将全文编译如下，以供读者阅读和思考。

基因组三维折叠的基本原理

过去十年间，人们对影响转录因子激活的染色质空间结构的理解取得了巨大的进步。诸如超分辨率显微镜和染色体构象捕捉等强大的实验技术提供了关于真核基因组如何在细胞核中精密组织的详细和多层次的观点。而基因组编辑和包括降解子（degron）介导的蛋白水解在内的蛋白快速敲除技术（near-instant protein depletion），则为阐明背后的分子机制做出了重要贡献。下面我们将讨论当前关于基因组折叠原理的认识（下图）以及转录因子在塑造和调控这一过程中的潜在角色。

泾渭分明而互有交叠的染色体区域

早在1885年，Carl Rabl就描述了有丝分裂完成时的染色体解凝（decondensation）现象，其后果是使每个染色体都单独形成一个相对封闭的细胞核内区域。然后，人们对于产生和维持这些独立区域的驱动力仍然知之甚少。尽管不同的染色体定位于不同的区域，但各区域之间仍有相当程度的重叠。在宏观上，选择性分离将染色体构建成两个染色体间交流中心（interchromosomal contact hub），即基因密集的聚集在核散斑（nuclear speckle）周围且与RNA聚合酶II（RNAPII）紧密联系的活跃染色质，和聚集在核仁周围的缺乏RNAPII却富集核糖体RNA基因的非活跃染色质。多项研究指出，不同染色体区域间的相互作用对于基因调控具有功能上的重要性，且多种转录因子都能参与介导这类染色体间相互作用。例如，CCCTC结合因子（CTCF）能够通过与核磷蛋白（nucleophosmin）的互作将染色质区域连接到核仁上，这表明转录因子能够诱导染色质重新定位到特定的核内亚区域。

染色体区域区室化（compartmentalization）

系统性地研究基因组区域之间的相互作用频率的技术的发展导致了多个三维基因组组织原理的发现。全基因组染色体构象捕获（Hi-C）实验表明，前述的每个染色体区域在空间上都可分离成两个亚区室，被称为A区室和B区室，分别主要由常染色质和异染色质对应的基因组区段组成。 A区室占据核内部，而B隔室位于核仁和核纤层（nuclear lamina）附近。与前述染色体区域间的相互作用类似，染色体区域内的基因组构象也显著决定了染色质的生物化学活性。

对单基因座位的功能研究表明，染色质相关蛋白，包括转录因子和染色质修饰酶，都可以独立于调控基因转录而诱导核重新定位和A-B区转换。例如，转录因子yin yang 1（YY1）和CTCF都被报道可将对应基因座位束缚在核纤层或核仁上。此外，在一项通过顺序表达CCAAT /增强子结合蛋白α（C /EBPα）和四种Yamanaka因子-OCT4，SOX2，KLF4和MYC（OSKM）将B细胞重编程为诱导多能干细胞的研究中，转录因子的结合调控也显著预兆了下游的A-B区转换。这些实验表明，由转录因子调节的染色质动态变化是细胞核中A-B区转换和基因座定位的主要驱动力。

相分离过程最近被报道在3D基因组构象形成中具有突出的作用。简单而言，相分离描述了一种现象，其中蛋白质自组织成液滴状聚集体，形成类似无膜细胞器的功能结构，能够富集特定分子并排除其他分子（下图a）。经由这一过程，含有低复杂性无序蛋白区域（low-complexity disordered protein regions）的序列特异性转录因子可以形成高度动态变化的核内聚合物，并与转录共激活因子或RNAPII相互作用。这些发现与揭示转录因子或多梳蛋白（polycomb protein）的结合位点在细胞核中存在空间共定位的实验结果相符。总之，由常染色质相关蛋白（如RNAPII，细胞周期蛋白T1（cyclin T1），中介体（mediator），含溴结构域蛋白4（BRD4）或转录因子）或异染色质相关蛋白（如多梳蛋白和异染色质蛋白1（HP1α））聚集形成核内复合物可作为染色体内或染色体间区室化的合理机制。

染色质内拓扑结构域

Hi-C分析揭示了通常被称为拓扑相关结合域（topologically associating domain， TAD）的在空间上相对隔绝的基因组区域。这些结构域经由何种机制形成一直是广泛研究的主题。 CTCF和粘连蛋白（cohesin）复合体富集于TAD边界，暗示TAD主要在CTCF-粘连蛋白结合位点之间形成。这一观察与其他实验证据催生了环挤出模型（loop extrusion model），用于解释TAD是如何形成的（下图）。在该模型中，挤出因子（例如环形的粘连蛋白复合体）将染色质环像将纱线穿过针眼一样挤出，直到遭遇与DNA相关联的屏障物。例如，CTCF仅在以特定取向与DNA相连时才会通过与粘连蛋白互作而成为染色质环挤出的屏障。通过敲除粘连蛋白（或其相关蛋白）来阻止染色质环挤出的发生会导致TAD在全基因组水平上的丢失以及染色体内区室化水平增加，表明这两者依赖于互相拮抗的不同机制（下图）。因此，染色体内区室化似乎是基因组三维折叠的默认机制，而染色质环挤出则建立了对进一步区室化具有抗性的相对隔绝的基因组亚区域。与该观点一致，在缺乏CTCF-粘连蛋白驱动的环挤出机制的果蝇中，TAD则主要通过对活跃与非活跃染色质的区室化而形成。

虽然CTCF-粘连蛋白的环挤出对于哺乳动物细胞中TAD的形成是至关重要的，但仍有相当数量的结构域边界不受CTCF敲除的影响。此外，在转录因子诱导的B淋巴细胞重编程的跨时间点研究中以及在神经分化的不连续阶段中，CTCF的结合动态模式无法解释TAD边界的动态变化，这表明存在其他未知的调节因子。由于几种转录因子如Krüppel样因子4（KLF4）和八聚体结合转录因子4（OCT4）已被证明与粘连蛋白存在相互作用，因此研究者推测它们也可通过染色质环挤出模型调节基因组构象。这一概念得到以下观察结果的支持：转录因子Zelda对于在果蝇胚胎发生过程中建立特定TAD边界具有重要作用。不同于染色质环挤出模型，对活性或非活性染色质具有亲和力的多价转录因子复合物可通过在不同基因组位点之间产生连接桥来形成拓扑结构域。这种自组织机制类似于转录因子——共激活因子互作诱导的凝聚体形成，表明相分离和区室化也可能在TAD形成中发挥作用。

值得注意的是，TAD本身并不具有同质化的准确定义。不同TAD之间的尺度差异很大，且往往表现为相互嵌套的层级结构（因而有时又被称做sub-TAD）。许多TAD由染色质环形成，并在高分辨率Hi-C图中显示为其顶点处的特征点状相互作用信号。然而，在这些由染色质环构成的结构域之外，亦存在非环状结构TAD（即缺乏点状Hi-C信号），它们往往与A、B区室结构域类似。后者近来被称为区室化结构域（compartmental domain）。因此，这两类TAD似乎是由不同的机制形成的，但目前尚不清楚它们在功能上是否也存在差异。

局部互作连接基因调控元件

启动子与增强子间的相互作用多数情况下发生在单个TAD之内，表明TAD限制了基因调控元件在核内的搜索空间（search space）。的确，当TAD边界遭受破坏或重建时，可促进新的启动子——增强子相互作用的形成，从而改变基因表达。TAD是基因调控的拓扑单元的观点进一步得到了以下观点的支持：TAD通常具有同质的染色质特征并表现出协同的转录反应。值得注意的是，TAD的形成过程，例如通过粘连蛋白驱动的染色质环挤出，亦可促进位于TAD边界附近的启动子和增强子之间的相互作用。

除了普遍存在的染色质相关蛋白如粘连蛋白和中介体外，一些谱系限制性（lineage-restricted）转录因子，包括LDB1、PAX5、KLF4和NANOG等，都可介导增强子——启动子互作。另外，经由蛋白质工程手段寡聚化的LDB1或YY1被证明可以驱动特定的启动子——增强子相互作用，这为转录因子在该过程中的丰富角色提供了令人信服的证据。与前述内容类似，由转录因子或其共激活因子诱导的相分离也为在TAD内形成精细染色质相互作用结构提供了合理的机制。在该类情形下，与传统的特定启动子——增强子相互作用的稳定锁钥模型（lock-and-key model）不同，转录因子通过局部聚集体的形成诱导基因调控位点之间的动态接触。

转录过程本身也可能影响核内空间中启动子和增强子的接近程度。除了RNAPII相关蛋白可能通过相分离在启动子——增强子区室化中起到重要作用，RNAPII本身聚集形成的动态复合体亦被认为可通过招募特定基因座来形成启动子——增强子互作环。此外，研究者发现转录激活程度与基因调控元件的机动性（mobility）相关，暗示了转录起始和启动子——增强子相互作用之间存在正反馈机制。

基因组三维构象与细胞命运决定

上述染色质在核内的非随机空间组织过程暗示了基因组三维构象在转录因子驱动的基因调控中的作用，并由此决定细胞命运。在本节中，我们讨论目前对基因组形态——功能关系的理解，并指出基因组三维构象可以通过促进或削弱转录因子功能来控制转录可塑性。

基因组三维构象的特异性与异质性

基因组构象在一定程度上是细胞特异性的。例如，染色体区域的空间位置在不同细胞类型之间有所变化。此外，胚胎干细胞分化过程中，基因与核纤层之间的联系也会发生变化（13-27％的核纤层相关结构域是动态变化的），而在细胞分化或重编程期间，A—B区室之间基因组交换的比例高达约35％。虽然TAD一开始被认为在不同细胞类型中具有不变的特性，但越来越多的证据表明，大约10-40％的TAD边界是细胞类型特异性的，且TAD边界的隔绝程度也是可塑的。不过，基因组构象中的具有最强动态变化特征的还数启动子——增强子相互作用，一些特定相互作用的发生概率表现出显着程度的细胞类型特异性。

当对单个细胞中的全基因组折叠特征进行分析时，基因组构象也表现出显着的细胞类型特异性。单细胞分析的结果符合染色体区室化、TAD和染色质环是存在于单细胞中的结构实体的观点，尽管它们都具有不同程度的细胞间变异。单细胞中的A—B区室状态似乎相当稳定，并且与对应的大体细胞测序得出的转录活性高度相关，与之相反，单细胞中TAD却是可变程度相当高的。这些结果表明，在细胞集群的不同个体间，一个特定基因往往仅与A或B区室相关联，相反，同一基因可以在尺度和聚集性不同的TAD之间变动，这亦符合在单分子成像研究中观察到的CTCF-粘连蛋白环的连续性形成和消解。值得注意的是，对粘连蛋白进行敲除不会消除单细胞中的TAD边界的形成，但却对TAD边界定位相当重要，这似乎解释了在粘连蛋白敲除的细胞群中由Hi-C图观察到的不同TAD边界的丢失。

基因组构象对转录调控的影响

近期关于在细胞分化或重编程过程中整合基因组三维折叠和基因表达动态变化的研究进一步展示了转录调控中基因组构象变化所发挥的重要作用。例如，由转录因子驱动的B淋巴细胞重编程为多层干细胞的的时程研究报道了染色质状态、基因组构象和基因表达之间的密切联系。因此，当细胞在不同状态之间迁移时，其基因组的空间组织的总体变化与局部转录和染色质状态密切耦合，控制这些区域中的基因是被激活还是被抑制（下图）。

那么基因组构象的特征具体如何影响基因转录呢？大量证据表明物理性接近（physical proximity）是增强子与启动子远距离互作的主要机制。例如，一项以定量显微镜为分析工具的实验表明，单个果蝇细胞中转基因的激活需要启动子——增强子持续处于邻近状态，另一项研究发现在哺乳动物细胞中的引导启动子——增强子产生相互作用能够激活基因表达。在核内相对隔绝的染色质区域（例如TAD和染色质环）的相互作用域被认为是通过限制增强子的核内搜索域及相关转录因子从而促进特异性启动子——增强子配对来发挥特定的基因调节功能。一项支持TAD在基因调控中的重要性的证据来自于将启动子报告载体随机整合至小鼠基因组中的实验，研究者发现当这种整合发生在同一TAD内时会产生对应的组织特异性表达模式。另外，活细胞中的单分子转录因子成像实验表明拓扑结构限制了细胞核中的转录因子运动动力学。正如这些研究所预测的，TAD边界或染色质环锚定物的删除（例如CTCF位点的缺失或倒置）经常导致邻近基因的表达改变。此外，染色体重排可破坏TAD边界，导致异常的的启动子——增强子连接，造成发育缺陷或肿瘤发生。例如，在WNT6-IHH-EPHA4-PAX3基因座处破坏TAD边界导致EPHA4基因的肢体发育特异性增强子介导的WNT6，IHH或PAX3异位激活（ectopicactivation），以及伴随的EPHA4本身的表达缺失。这一对基因组构象和基因表达的干扰会导致人类手指或脚趾发育畸形。TAD边界破坏也与重复序列扩增疾病（repeat expansion disorder）相关，例如脆性X染色体综合征（fragile Xsyndrome）。

如上所述，从染色质中删除CTCF或粘连蛋白会导致TAD结构的整体性破坏。但令人惊讶的是，拓扑隔离的显着丧失并未伴随广泛的转录失调（少于1,000个基因受到影响且表达水平的变化很小），暗示了拓扑结构域在调控增强子活性方面的作用较为有限。这表明，TAD边界要么主要对细胞的转录组进行微调控，要么仅对一部分基因的转录调控发挥重要作用。支持后一种观点的一项证据是粘连蛋白的快速降解对与大尺度增强子聚集体（超级增强子，super enhancer）相关的基因的调节影响最甚，这可能是由于超级增强子区室化后造成了与其靶基因的分离。另外一项研究证明，由CTCF-粘连蛋白敲除引起的增强子和启动子之间的新接触的形成仅在细胞表达能够募集必需转录共调节因子的相关转录因子时才造成基因表达改变。不过，这些研究给出的信息是有限的，因为他们只探究了CTCF-粘连蛋白敲除对稳态基因表达的短期影响。正是因此，最近关于粘连蛋白敲除影响巨噬细胞对内毒素的响应基因表达的发现便显得十分有趣，这表明TAD和染色质环相比起维持细胞基因转录状态而言对建立细胞转录调控网络更重要。

基因组构象的更高级三维结构，例如A-B区室化，与调节基因表达的功能相关性仍不太清楚，主要是由于在这些水平上人为操纵基因组三维折叠仍然是相当困难的。不过，已经有研究指出，将具有相似生化活性的区域聚集在特定核标志物周围或将它们分离至各染色体区室，可以通过增加相关因子的局部浓度来提高基因调控过程的效率。对核内空间中特定基因的位置在个体细胞之间显著变动（意味着基因在每个细胞中具有不同的长程相邻模式）的观察被用来说明核内的区室化和放射状基因定位过于随机而基本上不太可能影响转录调控。然而，在单细胞中观察到的可能由转录因子介导的凝聚物形成所驱动的基因的稳定A-B区室化，表明染色体区室化在转录调控中的角色可能比人们之前所预期的更重要。

形式（基因组构象）与功能（基因转录调控）的联系

该领域内存在一个围绕着基因组构象，染色质修饰和转录之间的因果关系的核心争论。仅仅依靠特定拓扑结构的存在并不足以启动基因调控过程。例如，将基因座连接到核纤层不一定能导致基因表达抑制，并且启动子——增强子相互作用的发生也不一定导致后续基因激活。另一方面，转录过程对基因组构象具有可探测程度的影响，转录活性也被用做计算机模拟中基因组三维折叠的参数。然而，以实验手段对基因组三维构象的操纵揭示了诱导启动子——增强子接近或破坏TAD边界可导致基因表达改变。相反，抑制转录却不会破坏现有的基因组构象，也不会阻止早期胚胎发育过程中基因组构象的建立或维持。此外，最近的一项研究表明PAX5转录因子即使在独立于转录的情况下也能够修饰基因组拓扑结构。最后，在将体细胞转化为多能干细胞的过程中，染色体区室化和TAD边界的变化通常先于基因表达变化，这就解释了关键多能性基因Oct4，Nanog和Sox2的在激活特征上的差异。因而，在细胞命运转换期间，功能（转录）似乎常常与形式（基因组构象）相符。

那么染色质修饰又起到什么样的作用呢？对B细胞重编程过程的多时间点分析揭示了转录因子驱动的染色质状态变化（由H3K4me2修饰表征）与染色体区室化变化同时进行或在其之前发生，而反向过程却几乎不存在。此外，染色质压缩组装和组蛋白的翻译后修饰足以改变基因定位或诱导A-B区室转换。这意味着转录因子介导的表观基因组修饰至少在区室化水平上可以驱动基因组构象变化。由转录因子和RNAPII调节的染色质状态的动态变化也被认为在调控TAD或TAD内部相互作用中具有积极作用，考虑到转录因子和共激活因子具有促进局部凝聚物形成的能力，这确是一种合理的机制。

总之，尽管基因转录、染色质状态和基因组构象之间存在连续的相互作用（下图），但基因组的空间组织并不一定以转录为必需。同时，由转录因子诱导的基因组构象改变可以为随后的转录变化创造一个可依赖的基础。因此，这些观察结果表明，基因组三维折叠在细胞命运决定中对于形塑基因表达程序具有重要作用。

转录因子与基因组构象互作

正如在本综述开始时所讨论的，细胞身份被认为是由转录因子，其他染色质相关蛋白和染色质空间构象之间的动态相互作用共同决定的。转录因子非常适合赋予染色质时空维度上的改变，因为它们具有细胞类型特异性表达特征，对信号的反应性以及DNA序列特异性和开拓难以接近的染色质的能力。不过，基因组构象可以抑制或促进与其靶标相关的转录因子的活跃程度，从而弱化或加强转录可塑性。在此，我们设想了四个功能上截然不同的角色，通过这些角色，基因组构象本身及其与转录因子的相互作用可以控制细胞命运：“屏障物”（barrier），“引导物”（primer），“优化者”（optimizer）和“促进者”（facilitator）（下图a、b、c、d）。虽然这些角色的划分可以帮助举例说明基因组三维组织如何影响基因调控过程，但下面阐述的机制通常则包含互有重叠和共同协调的方式。

基因组构象可以作为由激活转录因子的信号诱导的表型变化的“屏障物”，有效地对抗扰动而稳定细胞的状态。例如，通过通过能够检测多向染色质构象的技术可视化的被协同转录因子调控的基因群的共定位被认为可保护多能干细胞状态（下图a），比如NANOG可以直接诱导靶基因的空间聚类，形成一个调节中枢（regulatory hub）。又如，多梳蛋白复合物可以形成含有被抑制基因群的调节中枢。因此，由相同调节因子控制的基因群的空间接近性被认为增强了维持其活性或非活性状态的稳健性。从机制上讲，调节蛋白可以通过同型二聚化或通过低复杂性结构域之间的相互作用形成这种空间中枢。这反过来会引起（瞬时）相分离并驱动受调节基因的区室化。或者，基因组构象可以直接阻止诱导的细胞命运变化，例如拓扑结构域限制了与其靶标调控元件结合的转录因子的活性。此外，由于常染色质——异染色质（或A-B区室）相分离边界似乎是蛋白质扩散的屏障，染色质区室化可能会阻止激活的转录因子复合物进入液状B区室。这种情形解释了在B淋巴细胞重编程期间多能性基因Oct4几乎是瞬间被Yamanaka转录因子所激活，而Sox2则不是，因为Oct4已经存在于转录因子可接近的A区室中，而Sox2却是处于B区室中的（下图a）。

染色质构象也可以作为“引导物”，为转录因子提供破坏细胞稳定状态的机会（下图b）。预先形成的启动子——增强子相互作用可以产生一种预备的调节环境，使非活跃基因在接受特定的刺激后能进行快速激活。通过在A隔室中定位非活跃基因也可以产生类似的启动效果（例如下图a中的Oct4）。此外，基因调控复合体可以利用基因组构象来更有效地维持基因在发育过程中的预备激活状态。例如，多梳蛋白在多能细胞中介导形成的三维调节中枢增强了对分化相关基因的抑制，但同时也确保它们处于一个预备状态，从而能在遭遇分化信号时完成快速去抑制（下图b）。更一般地，多能干细胞中的基因组三维构象表现出独特的特性，可以解释它们非同一般的发育可塑性。依据这些原则，由高丰度的染色质相关高迁移家族蛋白B2（HMGB2）蛋白介导的拓扑重组被认为可用于预备细胞以激活后续衰老程序。

基因组拓扑结构还可以在转录因子诱导的细胞状态转换期间充当基因表达的局部“优化者”（下图c）。例如，细胞在重编程期间必须准确建立启动子和细胞多能性相关基因增强子之间的接触以确保正确的转录输出。在B淋巴细胞发育过程中，特定转录因子与免疫球蛋白基因增强子的结合确保了单个V、D、或 J片段具有相同的重组机会，从而最大化抗原受体多样性。这是通过基因座收缩（locus contraction）实现的，使得V段能够移动到靠近重组中心的位置，即使其位于超过一百万个碱基之外（下图c）。基因座收缩的功能受损并不能阻止重组发生和淋巴细胞成熟，相反，它会导致线性基因组中显著富集近端V段的重组。值得说明的是，在免疫球蛋白轻链基因座重组之前，转录因子在重组中心内结合增强子，并通过与兆碱基尺度的V基因区域的几乎随机的相互作用引发基因座收缩。在被称为增强子聚焦（enhancer focusing）的过程中，分化信号激活额外的转录因子以依次地优化上述相互作用并建立高度协调的增强子相互作用组，以校准V区段重组频率（下图c）。

最后，拓扑重组本身还可以充当“促进者”，在不依赖于特定信号响应调节因子的激活的情况下促进转录可塑性。例如，将LDB1的自缔合（self-associating）结构域与β-球蛋白（β-globin）基因的启动子相连，足以诱导β-球蛋白增强子与LDB1复合物的相互作用，激活基因表达（下图d）。这为染色质环化促进细胞命运转换的概念提供了原理验证。由于基因组构象是高度动态的且在一定程度上是随机性的，因此某些启动子——增强子相互作用的随机发生可能允许现有的转录因子复合物仅在一部分细胞中改变基因表达。因此基因组构象的自发变动可能通过为已存在的转录因子调控网络创造新的机会来塑造基因表达程序，从而诱导细胞命运的变化，包括与疾病相关的转录变化。这样的机制已经在造血干细胞中得到了实验描述，其中染色体3上发生了将GATA2的增强子整合到含有EVI1致癌基因的TAD中的拓扑重组（下图d）。这种新创建的基因组配置诱导EVI1过表达和GATA2水平降低，导致细胞转化和癌症发生。

总之，细胞状态特异性的基因组三维构象变化可能为调节因子发挥功能形成阻碍或创造机会，以保护或破坏细胞转录组的稳定性。在特定基因组构象的背景下，转录因子与辅因子和表观基因组的交替相互作用并催化自组织过程（例如，相分离中聚合物的形成）以形成新的基因表达程序和细胞身份。基因组拓扑结构和基因表达的这种相对缓慢但逐渐进展的变化与最近从小鼠和人类造血细胞的单细胞基因表达分析获得的证据一致。这些工作表明，多能祖细胞是通过连续的中间细胞状态而非激进的二元切换来分化成不同的谱系。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1182-7

制版人：小娴子

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