Nat Micro︱西湖大学陶亮博士等发现艰难梭菌毒素A的细胞受体

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艰难梭菌（Clostridium difficile）。图片引自：https://www.medicalnewstoday.com/articles/323045.php

艰难梭菌（Clostridium difficile）感染是工业化国家中造成医院和社区内获得性肠道腹泻的最主要原因之一。艰难梭菌感染往往在病人大量使用抗生素并造成体内肠道菌群的失调后发生，进而引发腹泻和伪膜性结肠炎，严重时可危及生命【1】。据2015年美国疾病控制和预防中心的统计数据显示，仅美国一地艰难梭菌感染的年患者估计约50万人，并造成约1.5万人死亡。欧洲疾病控制和预防中心的报告显示，2016年在20个欧洲经济体国家中的住院患者的CDI平均发病率约为42.9/10000，其中致死率占3.9%。鉴于抗生素的广泛大量使用，艰难梭菌感染已经对全球健康造成了严重威胁【2】。

艰难梭菌主要分泌毒素A和毒素B (TcdA和TcdB) 这两种外毒素蛋白引发疾病，尽管实验表明毒素B的致病能力更强，毒素A在疾病发生中的作用也绝不可轻视【3】。长期以来人们对毒素A的细胞表面识别过程不甚了解，这大大阻碍了对疾病发生的认识和治疗手段的研发。

2019年6月4日，西湖大学生命科学学院陶亮研究员联合波士顿儿童医院董民教授在Nature Microbiology上发表了题为Sulfated glycosaminoglycans and low-density lipoprotein receptor contribute to Clostridium difficile toxin A entry into cells的研究论文，报道了艰难梭菌毒素A可以通过识别细胞表面的硫酸化糖胺聚糖和低密度脂蛋白受体来入侵细胞。

该研究采用了一种基于CRISPR/Cas9技术的全基因组的敲除文库筛选的方法。文库中的单个细胞带有某个基因的缺失突变，当使用毒素A对文库进行多轮压力筛选后，带有某些基因突变的细胞会表现出对毒素的一定抗性，并得以在毒素存在的状况下存留下来。这些基因表达的蛋白产物通常在毒素与细胞作用的过程中起了重要贡献，接下来用高通量测序的方法对存留的细胞进行测序便可以得到相关基因的信息。

图1：用艰难梭菌毒素A对基因敲除文库进行逐级多轮的压力筛选来寻找与毒素A与宿主细胞作用相关基因蛋白的模式图。

在实际筛选中，基因冗余现象往往是阻碍实验成功的一大障碍。以受体冗余为例，当毒素可以利用多个受体入侵细胞时，由于它们之间的功能互补性，使得筛选结果可能无法得到其中的一些甚至所有的受体。该问题在研究艰难梭菌毒素A时尤其突出，因为毒素A蛋白的C端部分可以低特异性地识别例如Gal-Gal-GlcNAc的多糖结构。为降低筛选中的受体冗余性，研究者另辟蹊径，使用了一类C端截断的毒素分子来进行文库筛选。利用这种方法研究者此前曾成功地发现了艰难梭菌毒素B在肠道上皮中的重要受体Frizzled蛋白【4】。在对毒素A的研究中，研究者发现毒素在细胞表面存在有两类完全不同的受体分子：以硫酸乙酰肝素蛋白多糖为代表的硫酸化糖胺聚糖和低密度脂蛋白受体（LDLR）。

图2：筛选发现尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2(UGP2)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和一系列的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)合成途径蛋白的基因缺失细胞对艰难梭菌毒素A产生了抗性。

有趣的是，在介导毒素A入胞的过程中，硫酸化糖胺聚糖和LDLR的功能似乎是相互依赖的。硫酸化糖胺聚糖是一类在许多细胞表面非常丰富的聚糖分子，而低密度脂蛋白受体在细胞中有着快速再循环的特性。研究者认为毒素A分子首先被细胞表面丰富的硫酸化糖胺聚糖捕获并富集，然后递送给LDLR并由后者完成毒素快速入胞的过程。生物学家们对这种“两步传递”的模式并不陌生，比如呼吸道合胞病毒 (RSV) 就是首先结合到细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，然后利用ICAM1和VLDLR蛋白作为受体入胞的【5】。利用这种模式，病原体可以最大化地吸附到细胞表面并同时进行快速入胞。此外，鉴定艰难梭菌毒素A的细胞受体还将有助于开发新的疾病治疗方法。在研究中，研究者尝试使用了一种人工合成的硫酸化糖胺聚糖作为拮抗物，并成功降低了毒素A对小鼠肠道上皮的结合和损害。

据悉，西湖大学的研究员陶亮博士为该文章的共同通讯作者兼第一作者，哈佛医学院的田松海博士和张洁博士为共同第一作者，董民教授为共同通讯作者。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41564-019-0464-z

制版人：珂

1. Theriot, C. M. & Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annu. Rev. Microbiol. 69, 445-461, (2015).

2. Lessa, F. C. et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N. Engl. J. Med. 372, 825-834, (2015).

3. Kuehne, S. A. et al. The role of toxin A and toxin B in Clostridium difficile infection. Nature 467, 711-713, (2010).

4. Tao, L. et al. Frizzled proteins are colonic epithelial receptors for C. difficile toxin B. Nature 538, 350-355, (2016).

5. Bomsel, M. & Alfsen, A. Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 57-68, (2003).

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