『珍藏版』Mol Cell综述 | m6A背景依赖性功能的实现

责编 | 小柚、兮

近年来，随着m⁶A去甲基化酶的发现（FTO, ALKBH5）和测序技术的发展（m⁶A-seq, MeRIP-seq），以m⁶A为代表的RNA修饰的重要生物学功能吸引了研究者的广泛兴趣。RNA修饰组学分析被评为Nature Methods 2016年度方法【1】，Nature随后发布了相关的新闻特写（News Feature）【2】。在分子生物学层面，m⁶A可以调节mRNA分子经历的各个过程，包括可变剪切、出核、翻译、降解等。在生理过程层面，m⁶A可以调节干细胞分化、动物生长发育、果蝇性别决定、DNA损伤修复、热休克反应、学习与记忆、癌症发展、免疫反应等方方面面【3,4】。转录组上m⁶A的分布由甲基转移酶复合体与去甲基化酶决定，m⁶A的功能则由对其特异性识别的蛋白执行。对这些蛋白（effectors）在各种各样的生物体系中的研究展现了m⁶A修饰功能的多面性和可调节性，也强调了理解特定的局部生物情形在认识m6A功能中的重要性。

2019年5月16日，芝加哥大学何川课题组（共同一作为施海玲与魏江博博士）在Molecular Cell杂志上发表综述Where, When, and How: Context-Dependent Functions of RNA Methylation Writers, Readers, and Erasers，在这篇综述中，作者从m⁶A甲基转移酶，甲基识别蛋白，以及去甲基化酶三个方面详细总结了m6A功能研究领域的新进展，着眼于不同生物情形带来的m6A的不同生物学效果。

一、RNA修饰的复杂性

一方面，RNA分子本身存在丰富的异质性，包括RNA种类、拷贝数、二级结构、细胞内分布等；另一方面， m⁶A effectors在不同的生物体系中也存在表达量、细胞定位、或者翻译后修饰等方面的差异，或受到环境刺激的影响；再者，RNA分子与蛋白的结合模式复杂多变【5】，effectors与RNA底物的识别也受调控于周围的RNA序列和RNA结合蛋白。在对m⁶A effectors以及m6A的功能进行研究时，有必要考虑到这些复杂性带来的挑战。

二、m⁶A甲基转移酶：多样的细胞定位及功能

绝大多数的mRNA上的m⁶A甲基化由以METTL3/METTL14为核心的甲基转移酶复合体完成。其中METTL3起催化作用，METTL14则辅助RNA底物结合【6,7】。复合体中的其他组成蛋白包括WTAP，VIRMA，ZC3H13，RBM15/15B，HAKAI等，对复合体稳定性、细胞定位、以及mRNA 3‘UTR的 m6A甲基化起调节作用。

RNA修饰领域的一个重要问题是，m6A甲基化的转录本特异性如何实现，或者说，m6A甲基转移酶复合体如何被招募至特定的染色质位点？一种可能性是，在特定的生物体系和情形下，某些转录因子（transcription factors）可与甲基化酶复合体的某个组成蛋白结合，实现转录因子下游的基因产物的特异性m⁶A甲基化。例如，在人类多能性干细胞中，转录因子SMAD2/3在受TGFbeta信号通路激活后，可以识别METTL3/14【8】；在AML细胞中，METTL3在染色质上的一部分启动子结合位点由转录因子CEBPZ介导，对AML癌症状态维持起重要作用【9】。不久之前，陈建军课题组报道了在HepG2细胞中，组蛋白修饰H3K36me3可招募METTL14（专家点评Nature丨陈建军/杨建华/何川/黄刚合作揭示RNA m6A由组蛋白修饰决定）【10】。 H3K36me3是一种在活跃基因的基因体（gene-body）上富集的组蛋白修饰，这种分布特点可以解释m⁶A甲基化在mRNA编码区（CDS）和3’UTR富集的现象。

METTL3的氨基酸序列中含有核定位信号，但在某些癌症细胞系或样品中，一部分METTL3蛋白也存在于细胞质中，并起到不同于甲基转移酶的作用。例如在肺癌细胞中，METTL3结合甲基化的mRNA并与翻译起始因子EIF3H相互作用，从而促进mRNA的翻译（深度丨RNA m6A修饰直接调控肿瘤发生吗？这篇Nature有话说）【11】。

除了由METTL3/14催化的在序列RRACH（R=A或G，H=A,C或U）的m⁶A甲基化，另外两种m⁶A甲基转移酶则作用于具有不同序列和二级结构特征的RNA。METTL16催化U6 snRNA上的甲基化，mRNA MAT2A（编码SAM合成酶）上一个类似U6的RNA发夹结构也是它的底物【12】。ZCCHC4则负责28S核糖体RNA上A4220位的在AAC序列中的m6A甲基化【13】。

三、m⁶A识别蛋白：复杂精细的m⁶A功能

第一类m⁶A识别蛋白通过一个特殊的RNA结合结构域YTH domain直接结合m⁶A。其中，YTHDF2促进m⁶A修饰的mRNA的降解，YTHDF1和YTHDF3促进m6A修饰的mRNA的翻译，YTHDC1实行细胞核内调控剪切和mRNA出核等多种功能，YTHDC2则调节精子成熟过程中的RNA降解和翻译【14】。另外，由m⁶A甲基化引起的RNA底物局部结构的变化也可调节RNA结合蛋白对底物的结合强度，这种现象被称为“m⁶A-switch”【15】。HNRNP C, HNRNP G, 以及HNRNP A2B1属于这类m⁶A识别蛋白，调控RNA底物在核内的成熟过程。近些年，研究者们通过对RNA结合蛋白在RNA上的识别位点的数据挖掘以及m⁶A探针亲和沉淀蛋白定量质谱的运用，发现了更多通过典型的RNA结合结构域识别m⁶A修饰的RNA的蛋白，包括FMRP和IGF2BP1-3【16,17】。不同种类的m⁶A识别蛋白丰富了m6A生物功能的多样性。

同样的，m⁶A识别蛋白如何实现对m⁶A修饰的mRNA或m⁶A位点的选择性也是亟待解决的问题。m6A位点发生的区域（如5‘UTR，CDS，或3’UTR）以及m⁶A位点密度等的不同，可能招募不同的识别蛋白。另外，m6A识别蛋白可能富集于特定的亚细胞结构中，从而特异性调节周围存在的mRNA。例如，部分识别蛋白被报导富集于细胞应激颗粒（stress granule）或者细胞的轮廓处【18,19】，来自细胞整体的混合信号可能会掩盖m6A在亚细胞结构中的特异性功能。再者，一些m⁶A识别蛋白表现出对细胞刺激过程的响应。在热休克过程中，YTHDF2出现入核的现象【20】。特别的，YTHDF1介导的促进翻译效应突出表现在由环境信号引发的蛋白翻译活跃的过程中，例如神经轴突的修复或记忆形成等【21,22】。一个特定的m6A位点的生物功能取决于在特定生物情形下被何种m6A识别蛋白结合。

四、m6A去甲基化酶：甲基化底物的选择

FTO是第一被鉴定的mRNA上的m⁶A去甲基酶【23】，后又被报道催化mRNA 5’端帽m6Am的去甲基化【24】。到底FTO的哪一种去甲基化功能具有主要的生物学意义呢？

首先，细胞内端帽m⁶Am的含量只占m⁶A含量的1/30-1/10，尽管前者是FTO在体外酶活反应中动力学优先的底物，后者可能是FTO在细胞内更占优势的底物。其次，在甲基化底物的选择性上，何川课题组在2018年详尽地报道了不同细胞系中的FTO的底物范围【25】。他们发现FTO的细胞内定位调控了其对生理条件下相关底物的选择性。定位于细胞核的FTO主要作用于m⁶A而非端帽m⁶Am的去甲基化，可能的原因是端帽结构在细胞核中受到端帽结合蛋白复合体的保护；定位于细胞质中的FTO则可介导m⁶A以及端帽m⁶Am两者的去甲基化。在一些AML细胞系中，FTO高表达且定位于细胞质中，介导了~40%的细胞质mRNA的去甲基化，并且FTO介导的MYC上的m⁶A去甲基化起到了促进癌症的作用【26,27】。再次，随着端帽m⁶Am甲基化转移酶PCIF1的发现与鉴定【28-31】，端帽m⁶Am甲基化的生物学重要程度逐渐明朗。不同于m6A，PCIF1介导的m⁶Am甲基化并不显著影响其mRNA底物的表达量或稳定性。关于m⁶Am甲基化如何影响底物的翻译，不同报道中尚无统一的结论。

五、结语

随着对m6A甲基化研究的深入，其生物学功能的多样性和复杂性也逐渐凸显，受调控于不同层面的生物学情形。细胞的增殖分化状态、细胞信号通路和对环境刺激的响应、m6A effectors的细胞定位、以及m6A位点在mRNA上分布等都可影响m6A的功能，值得研究者们的注意。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.04.025

制版人：小娴子

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