专家点评Science+Nature长文| 当CRISPR遇上转座子——实现位点特异性DNA片段的高效、特异插入
撰文 | 陈哲博士
点评丨周昌阳、杨辉（中科院神经所、脑科学与智能技术卓越创新中心）
责编 | 兮
CRISPR-Cas系统是原核生物抵御外来遗传元件侵袭的一种适应性免疫机制，它通过RNA引导的核酸酶来降解外源质粒、病毒等遗传物质【1】。由于其靶向性依赖于核酸碱基对间的配对，而非复杂的蛋白-核酸识别，所以成为了基因组编辑应用的首选，并发展出了针对DNA和RNA进行编辑、调控、检测在内的一整套工具箱【2】。这些成功也激励着科研人员进一步寻找新的CRISPR-Cas系统并开发新的基因组编辑应用。
在基因组中位点特异性的插入DNA片段具有重要的实用价值，虽然通过CRISPR-Cas系统对基因组目的位点进行切割，然后通过同源重组或非同源重组的方式能够实现目的DNA片段的插入，但是这种方案效率很低并且依赖于待编辑细胞的特性，所以高效且特异的整合目的DNA片段到基因组中仍然存在巨大挑战【3】。转座是一种特殊的遗传重组，它将特定的遗传因子从DNA上的一个地方移位到另一个地方。因此，一些科学家就想到利用转座子来实现DNA片段的高效、特异插入。
2017年8月15日，发表在PNAS上的一项工作发现了一类编码在Tn7-like转座子中的CRISPR-Cas系统【4】，它能够加工、结合crRNA，但不能切割靶DNA，这提示它可能能够介导RNA引导的位点特异性转座【5】。近日，Science和Nature上各发表了研究长文，通过实验证实了编码在转座子中的CRISPR-Cas系统确实能够介导RNA引导的位点特异性转座，扩展了人们对转座子和转座机制的认识，并且为在基因组中位点特异性的插入DNA提供了新的备选方案。
2019年6月6日，美国麻省理工学院Broad研究所的张锋研究组在Science发表了题为：RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases的工作；2019年6月12日，美国哥伦比亚大学的Samuel H. Sternberg研究组在Nature发表了题为：Transposon-encoded CRISPR–Cas systems direct RNA-guided DNA integration的工作。这两项工作内容比较相似，张锋组在证明蓝细菌中的CRISPR-associated transposase (CAST)具有RNA引导的转座酶活性外，侧重于对这个系统进行改造和评价其用于基因组编辑的性能；而Samuel H. Sternberg组则侧重于描述霍乱弧菌中的一种Tn7-like转座子本身，在最后简要评估了将其应用于基因组编辑的潜力。
下面，通过比较来认识一下这两套系统：
1. 转座子骨架
Samuel H. Sternberg组使用I-F CRISPR–Cas系统，而Feng Zhang组则使用V-U5 CRISPR-Cas系统。V-U5系统在应用上远比I-F系统简单，V-U5系统的CRISPR-Cas系统仅由一个单亚基的Cas12k（~85 kDa）构成，而I-F系统则由Cas8、Cas7、Cas6按1:6:1组成Cascade异多聚体（~300 kDa）。V-U5系统的转座酶相关蛋白由tnsB、tnsC和tniQ组成，而I-F系统的转座酶相关蛋白由tnsA、tnsB、tnsC和tniQ组成（下图）。
2. 荷载DNA片段大小及插入效率
3. 插入的特异性
通过对大肠杆菌基因组DNA进行的插入实验，张锋组发现蓝细菌来源的ShCAST介导的DNA插入有一定的脱靶率（< 50%），并且脱靶位点有一定的偏好性，且不依赖于gDNA序列；而Samuel H. Sternberg组则发现，霍乱弧菌来源的Cascade介导的DNA插入的脱靶率很低（< 5%），并且脱靶位点没有偏好性。
4. 其它不同之处
张锋组发现，ShCAST介导的DNA转座插入具有方向性；而Samuel H. Sternberg组发现，Cascade介导的DNA转座插入不具有方向性，正反向插入都有可能。张锋组发现已插入的转座子对ShCAST介导的再次转座插入具有很强的抑制性；而Samuel H. Sternberg组则没有进行相关验证。此外，张锋组根据tracrRNA和crRNA设计了sgRNA，而Samuel H. Sternberg组没有设计。
CAST系统规避了对基因组DNA的切割和对DNA损伤修复系统的利用，直接通过RNA引导的转座酶进行目的DNA的插入，比现有技术存在很多优势。通过对ShCAST和Cascade这两个系统的比较，可以看出它们目前还都不完善，有待进一步的打磨。随着后续结构及生化研究的深入及进一步的功能筛选，相信不久以后就能得到更为高效和特异的CAST，以便我们进行各种科研、医疗及生产上的应用。
原文链接：
https://science.sciencemag.org/content/early/2019/06/05/science.aax9181
https://doi.org/10.1038/s41586-019-1323-z
专家点评
周昌阳、杨辉（中科院神经所、脑科学与智能技术卓越创新中心）
通过CRISPR系统对目的位点造成DNA双链断裂(double-strand break, DSB)可以分别利用非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)或者同源介导的双链DNA修复（homology directed repair, HDR）对目的位点进行编辑，能够实现基因的敲出，敲入或者点突变等精确的基因编辑，但是同源重组较低的效率和DSB引起染色体易位、重排等风险阻碍了基因编辑技术在疾病治疗中的应用。2016年David Liu研究组开发的BE3系统首次提出可以不切断DNA双链的前提下进行精确的基因编辑获得广泛的关注和应用。但该系统仅能够进行单碱基编辑，开发一个无需DSB便能将外源DNA片段定向插入的工具一直基因编辑领域突破的热点。
近日，美国Broad研究所的张锋团队和哥伦比亚大学的Samuel H. Sternberg团队前后分别在Science杂志和Nature杂志报道了基于CRISPR系统和转座系统的定点DNA插入系统。分别采用了V-K CRISP-Cas和 I-F CRISPR-Cas系统，实现了不产生DSB的情况下将外源DNA片段定向插入到细菌的基因DNA中。两个系统相较而言，张锋团队的shCAST系统更小，而Samuel H. Sternberg团队的Cascade系统更加特异，此外，另外一个重要的问题就是张锋团队的插入系统具有方向性，Samuel H. Sternberg团队的插入系统可以正反方向随机插入，降低了用于疾病治疗时的精确性。
在很多由于基因突变或者缺失导致的疾病中，可以利用基于转座的定向插入系统进行基因修复，相比现有的利用同源重组的编辑方式在安全性和效率上都具备天然的优势。值得注意的是目前这两项研究都还并未实现在哺乳动物细胞或者模式动物水平进行DNA的定向插入，在距离真正的应用到疾病的治疗上还有待进一步优化的空间。虽然目前只是实现了第一步，但已经非常令人鼓舞。
参考文献
1. Barrangou, R. & Horvath, P. A decade of discovery: CRISPR functions and applications. Nature microbiology 2, 17092, doi:10.1038/nmicrobiol.2017.92 (2017).
2. Pickar-Oliver, A. & Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature reviews. Molecular cell biology, doi:10.1038/s41580-019-0131-5 (2019).
3. Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S. & Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS chemical biology 13, 389-396, doi:10.1021/acschembio.7b00777 (2018).
4. Peters, J. E., Makarova, K. S., Shmakov, S. & Koonin, E. V. Recruitment of CRISPR-Cas systems by Tn7-like transposons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 114, E7358-e7366, doi:10.1073/pnas.1709035114 (2017).
5. Faure, G. et al. CRISPR-Cas in mobile genetic elements: counter-defence and beyond. Nature reviews. Microbiology, doi:10.1038/s41579-019-0204-7 (2019).
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