再创丨创造一个细胞需要什么?

自下而上地将表征充分的功能性分子、元件、模块重建为合成细胞，将为生命的机制和起源提供新的见解。然而，核心挑战是如何利用细胞组件在体外重新组织胞内反应过程。本文总结了能够促进合成细胞领域发展的相关工作，并把重点集中在以下方面：

1. 可靠的膜模型和微环境

2. 动态遗传调控和自我维持的转录和翻译机器

3. 空间组织的细胞骨架，以支持3D的生物结构和细胞复制

图1. 多种领域、工具、技术的总结示意图，它们将促进功能模块向合成细胞的时空组装 

膜和微环境

磷脂膜作为细胞与外部环境的交界面，能够保持稳定的内部微环境，控制内外物质交换，协助细胞骨架塑造细胞形态，承载多种蛋白质机器以实现各种生理功能。磷脂膜可以说是合成细胞最基本的分隔单元。

为了产生类似细胞的微环境，人们通过或多或少的、合成或天然的脂质的异质组装来模拟细胞膜。到目前为止，各种膜模型已经被开发出来，并在组成、不对称性、结构和其他机械性质上不断调试。而且研究者们也构建了不同维度的膜模型，从二维的支撑脂质双层膜（supported lipid bilayers, SLBs）到三维的巨型单层囊泡（giantunilamellar vesicles, GUVs）。

图2. 不同维度的膜模型

固体支撑的脂双层（SLBs）具有生物膜的许多特性，而且具有简化的、可控的拓扑性质，最近受到了合成生物学家的极大兴趣。SLB很稳定，特别适用于表面探测技术，但是静态的支撑物限制了膜转化的潜力，导致诱导膜转化的蛋白机器无法应用到膜上；而且由于忽略了Z轴上的信息，这种二维的支撑膜不能实现真实3D细胞环境的结构复杂性（图2，左）。

为了更好地模拟细胞的3D特征，尤其是其形状和大小尺度，聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为一种柔性支撑体，可以被微加工成各种拓扑模型，如特定体积的区室（图2，中）。这种微制造的区室更像是大肠杆菌之类的杆状形状，因此它为重建大肠杆菌的体积依赖型的蛋白质功能提供了良好的环境。但是它仍然无法摆脱这样的问题：这种方法得到的膜是不可收缩的，而且这种区室是不封闭的。

为了克服这些限制，研究者们利用胆固醇和天然无毒磷脂构建了球型、封闭的巨型囊泡（脂质体）（图2，右）。脂质体可以用不同的方式大量生产，比如水合（hydration）、电穿孔（electroporation）、挤制（extrusion）和溶剂蒸发等方法。然而这些技术并不能实现精确控制，产生的脂质体体积变化范围大，封装效率低，而且有时候与特定的细胞模块不相容。

图3. 微流控技术

最近，微流控技术的使用使得在芯片上高通量地产生和操作脂质体成为可能，它显著提高了脂质体包封的效率，并使它们的大小更加均匀。微流控装置也被用于实现细胞大小的脂质体的机械分裂（图3，左）；控制脂质体的融合、捕获、实时分析、分选，并通过短电脉冲将底物注射到囊泡中（图3，中）。另一方面，利用微流控技术和表面活性剂的联用可以创造含有多区室的囊泡，模拟细胞内的细胞器（图3，右）。光激活的酶反应已经被组装到这种多区室的囊泡中，呈现出从生物催化到药物呈递的应用潜力。最近，人造光合细胞器在原细胞（protocell）系统中被构建出来，以模拟叶绿体并创造一个自我维持的合成细胞。

图4. DNA纳米技术

微流体技术具有高度再现性、自动化和多种不同的操作特性，是重建生物系统的强大工具。然而，为了在更小的空间尺度上产生更高的控制精度，DNA纳米技术最近被用于开发新一代的工具，以模拟纳米尺度上难以体外获得的天然物体。代表性的例子是用于膜雕刻的DNA支架（图4，左）、用于控制脂质体大小的DNA折纸模板（图4，中）、基于DNA的膜锚定和DNA编程的膜粘附（图4，右）等。这种人造纳米装置将为合成细胞提供可编程部分，进而控制预先存在的生物组分来模拟天然细胞组分。 

转录-翻译机器

在自然界中，细胞可以通过转录和翻译响应外部刺激并自我调节体内平衡，从而在不同的时间点协调不同的细胞过程，其中涉及各种生物组分，特别是基因组、转录翻译机器和感觉/信号转导模块。

在体外，各种无细胞蛋白质合成（cell-free protein synthesis, CFPS）系统被用于动态控制蛋白质的体外生产和功能行使。CFPS系统通过来自活生物体的核心转录和翻译机器发挥作用。为了实现对CFPS系统的调控，大肠杆菌σ因子、不同的RNA聚合酶（T7,SP6,大肠杆菌RNAP）以及一系列的抑制子被改造并用于控制CFPS的转录速率。除蛋白质调控因子外，RNA分子本身也可以行使转录调控（RNA 转录弱化子，支点开关toehold switches）和翻译调控 (核糖开关，RNA温度计) 的功能。由于其体积小、结构灵活、可编程和直接可控，RNA工具或将是一种替代蛋白调控元件的良好选择。

在这些元件的基础上，基本的基因线路模体可以被构建出来，用于基于逻辑运算的控制，如反馈回路、前馈回路和体外环形振荡器。

图5. 合成最小基因组²

这些体外基因线路可以在无细胞环境中进行逻辑处理，使我们能够设定系统行为随时间的变化。但是这种基因线路只能控制一种或少数蛋白质的变化，无法与细胞中基因组控制的数千种蛋白质组织网络的复杂性相比拟。然而我们可以通过理性设计、化学合成最小基因组，并将其构建到活细胞中（图5）。可以想象，如果将最小基因组和CFPS组合在一起，在未来将可能获得完全活跃的合成细胞。

为了实现这一宏伟目标，仅依赖于时间依赖的基因调控是不够的，还需要设计其空间拓扑结构。在细胞中，转录-翻译机器的空间组织还有赖于在狭小体积的微环境内的扩散调节。为了模拟如此小而拥挤的环境，CFPS被封装到细胞大小的区室中。由于功能元件更频繁地碰撞，这种区室环境可以提高转录和翻译效率，而拥挤的环境还可能限制扩散的速率；实际上，区室中的CFPS似乎会表现出随机行为。使用高通量液滴微流控，可以量化拥挤环境中的基因表达噪声，从而使研究者能在皮升（pL）的体积环境中重构CFPS时考虑随机性的影响。

图6. 合成无细胞DNA复制系统³

自我维持是自主活细胞的基本属性，它依赖于在细胞内或环境中的空间自组织。DNA复制和产生足够数量的子细胞功能蛋白是维持细胞周期的关键要求。最近φ29病毒的DNA复制机制在无细胞基因表达系统中重建(图6)，为合成细胞的进化功能奠定基础。

代谢，即细胞和其环境之间的物质循环，为细胞结构的三维自组装和细胞动态的四维自组织提供能量和物质模块。到目前为止，在CFPS中已经重建了不同的功能代谢途径。在存在膜纳米孔（天然转运蛋白或人造孔）的情况下，新物质可以穿过膜，补给并维持长期的生物反应过程。在这种自我更新系统中，我们可以在合成细胞内或合成细胞间设计并实现基因线路的相互作用。

细胞骨架

细胞骨架不仅维持着细胞的形状，而且在许多活跃的过程中起着不可或缺的作用，如细胞内的物质运输、细胞分裂和细胞运动。到目前为止，许多原核和真核细胞骨架的最小结构模块已经被确定，抽提，并在体外重构出来。

对于细菌的细胞骨架，细胞分裂相关的微管蛋白同源蛋白，FtsZ，已经通过肌动蛋白相关蛋白FtsA或人造膜锚定蛋白重构到人造膜上。它已经被证明可以自组织成复杂的模式，如快速移动的丝束和手性旋转环。

为了模拟真核细胞中存在的皮质肌动蛋白，研究者们在支撑脂双层（SLB）上重建了由F-肌动蛋白和肌球蛋白II的最小细胞骨架系统。外源添加ATP时，肌动蛋白和肌球蛋白体外形成的合成肌丝产生力，肌动球蛋白（肌动蛋白和肌球蛋白的复合体）快速收缩，导致膜横向结构的变化。其他肌动蛋白相关蛋白（如锚蛋白，成核因子，延伸因子等）的引入可以进一步调控皮质肌动蛋白的动态。

DNA纳米技术也被用于创造具有多种可编程特征的人造细胞骨架。例如，Y形DNA细胞骨架可以在凝胶相（gel phase）中形成致密的网络结构，从而可以用作人造细胞骨架来稳定脂质体。合成的核酸步行者（nucleic acid walker）也可以被改造用于可调谐的空间物质运输。DNA纳米管支架可以使人工肌球蛋白纤维产生较大尺度的运动和力，这也是重构肌肉活动的第一步。

最后，分裂是活细胞最明显而独特的特征之一。细胞中有大型蛋白质机器负责分裂过程中的空间组织和排列。为了模拟细胞分裂，研究者们将基于FtsZ及它的一些调控因子封装到脂质体中，并尝试去诱导膜的形变。具有天然或人造膜锚的FtsZ可以在脂质体内部或外部形成弯曲的细丝或环，进而使囊泡膜变形，起到类似Z环收缩的作用。就目前的结果来看，尽管FtsZ的活性能够使一些脂质体分裂，但脂质体中严格意义上的Z环组装难以重复，导致我们很难去把这些结果量化。尽管Z环可以在脂质体内部形成，但它们的位置仍然是随机分布的，而且目前形成的Z环尺寸过小，也不能诱导大尺度的囊泡形变。

同样，体外重构的肌动蛋白皮质可以产生张力并驱动脂质体的形状变化。肌动球蛋白可以在脂质体中形成收缩环，但没有报道显示膜发生了形变。

尽管在某些情况下，我们通过体外模拟的细胞骨架可以导致膜的形变，但如何在体外重建一种可以介导母细胞自发或可控分裂的分裂机器，仍然是一个巨大的挑战。由于细胞分裂过程在自然界具有复杂的时空调控，因此，如何定义一系列简化的功能模块，并把它们组装起来以模拟这个过程将是一个关键点。最近借助微流控注射技术，经过纯化的跨膜蛋白和细胞骨架蛋白可以依次装载到人造囊泡中，这显示出在人造细胞中有效组装功能元件的极大潜力。

总结

自下而上地组装功能元件来体外合成生命系统，是现代合成生物学的一大挑战。这样的尝试可能会持续很多年，但是它不仅会提供对生命的基本属性的全新理解，还会揭示许多未被充分了解的细胞机制。尤其是虽然我们已经体外重建了许多基本元件，但他们之间的分级组装和时空联系仍然是非常有趣的。毕竟，生命的奥秘不仅在于它的组成模块，还在于它们特定的相互作用。

到目前为止，与自然界中许多不同的细胞功能相比，体外开发的功能元件仍然是冰山一角。此外，如何使不同的元件兼容地在同一个人造细胞中发挥作用，同时维持较高的稳定性以满足长时间的反应，对任何一种无细胞技术来说都是至关重要的难题。在这些方面，时空尺度上组装细胞的探索将需要更多生物学家、化学家、物理学家、生物技术学家、微技术学家和纳米技术学家的共同努力和灵感贡献。

参考文献：

1. Jia, H.; Schwille, P.,Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Curr Opin Biotechnol 2019, 60, 179-187.

2. Hutchison, C. A., 3rd;  Chuang, R. Y.;  Noskov, V. N.;  Assad-Garcia, N.;  Deerinck, T. J.;  Ellisman, M. H.;  Gill, J.; Kannan, K.;  Karas, B. J.;  Ma, L.; Pelletier, J. F.;  Qi, Z. Q.;  Richter, R. A.;  Strychalski, E. A.;  Sun, L.; Suzuki, Y.;  Tsvetanova, B.;  Wise, K. S.; Smith, H. O.;  Glass, J. I.;  Merryman, C.; Gibson, D. G.; Venter, J. C., Design and synthesis of a minimalbacterial genome. Science 2016, 351 (6280), aad6253.

3. van Nies, P.;  Westerlaken, I.;  Blanken, D.; Salas, M.;  Mencia, M.; Danelon,C., Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based syntheticcells. Nat Commun 2018, 9 (1), 1583.

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