外泌体如何成为协助肿瘤免疫逃逸的帮凶

免疫逃逸是肿瘤细胞逃生的一个非常重要的机制，PD-L1和PD-1结合就是其中一个重要路径，因此靶向PD-L1\PD-1的抗体药成为热门的解除免疫抑制，治疗肿瘤的药物。但是在前列腺癌中，PD-L1的表达量很低，所以通常对PD-L1抗体不响应。那么为什么前列腺癌细胞上PD-L1的表达量偏低呢，除了细胞内的PD-L1之外，胞外的PD-L1是否也可以行使免疫抑制的作用。也有报道发现PD-L1可在胞外囊泡表达，并且参与免疫抑制。在胞外囊泡中，有一大类引起广泛关注的囊泡，便是外泌体。近几年针对外泌体在机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、肿瘤微环境、肿瘤生长与侵袭等各种生物过程中的研究层出不穷。那么，外泌体是否可能携带PD-L1分泌至胞外，协助肿瘤进行免疫逃逸，而且还能不受PD-L1抗体的追杀呢？下面，我们来看一下一篇4月初在CELL上发表的文章，看看外泌体是如果成为肿瘤的帮凶的。

首先，作者要分析，为什么前列腺癌细胞上的PD-L1的表达量较其他肿瘤低，是转录前还是转录后因素，或者翻译前、翻译后机制导致的这个现象？作者对前列腺癌细胞PC3,DU145, LNCaP上的PD-L1的mRNA和蛋白水平进行了分析，并与黑色素瘤细胞SK-MEL-28进行比较，发现在PC3,DU145早上PD-L1的mRNA水平比SK-MEL-28高了近15倍，但是蛋白水平在三株细胞中类似，在LNCaP上PD-L1无论是mRNA还是蛋白均几乎不表达。但是分析PC3和SK-MEL-28细胞中PD-L1的翻译速率以及降解并无显著影响。那PD-L1是否有可能通过胞外囊泡将胞内蛋白释放到了胞外呢，果然，通过密度梯度离心分离得到细胞培液上清中的囊泡，发现PC3细胞上清囊泡中的PD-L1是SK-MEL-28的2-3倍高，说明PC-3细胞中多翻译的那部分PD-L1的确是被包裹进囊泡中释放到了胞外，并且该类囊泡主要是外泌体（Fig. 1）。

Fig. 1

紧接着，作者运用CRISPR-CAS9方法分别敲除了PC3细胞上的Rab27a和nSMase2(控制外泌体合成分泌的关键蛋白)，发现PC3分泌的外泌体显著减少，同时胞外囊泡中的PD-L1的蛋白量也显著减少。并且，缺失 PD-L1的Raji B细胞与Jurkat T细胞共培养时，IL-2可以大量分泌，表明T细胞被激活。而当引入PC3的的外泌体，可重新抑制IL-2的分泌，说明PC3外泌体可代替Raji的PD-L1表达来抑制T细胞活性（Fig.2）。

Fig. 2

为了回答外泌体中的PD-L1在体内是不是也能起到促进肿瘤的作用这一猜测，作者进一步运用TRAMP-C2模型来验证外泌体中的PD-L1在体内的功能。在TRANP-C2细胞上敲除PD-L1或者Rab27a均不影响体外细胞的增殖，将WT、Rab27a null、nSMase2 null以及PD-L1 null TRAM-C2细胞注射到C57BL6/J小鼠皮下后，WT TRAM-C2造模小鼠肿瘤快速增大，在40-71天就必须进行安乐死，而另三株基因编辑细胞造模小鼠则没有看到明显的肿瘤增长，而且大部分小鼠存活至90天以后。但是将这四株细胞移植入免疫缺陷NSG小鼠，结果与C57BL6/J小鼠中完全不同，肿瘤的生长速率以及小鼠的存活期并无显著差异。以上结果说明Rab27a、nSMase2以及PD-L1是通过抑制了免疫系统而促进肿瘤的生长（Fig.3）。

Fig. 3

对WT TRAMP-C2以及Rab27a null、 PD-L1 null TRAMP-C2细胞造模的小鼠进行观察，发现在14天时，基因编辑细胞造模的小鼠脾脏显著大于WT TRAMP-C2造模小鼠，但是脾脏内的CD8+,CD4+ T细胞以及Treg的比例在各组间是类似的。肿瘤引流淋巴结(tumor-draining lymph node,TDLN)是肿瘤细胞沿淋巴管所能到达的淋巴结,是肿瘤免疫发生的部位，在这个区域，作者发现基因编辑细胞造模小鼠的引流淋巴结区域内，CD8阳性细胞占据了T细胞的绝大部分，而CD4阳性细胞比例显著下降，FoxP3+ T reg的变动幅度不大。通过对CD8+, CD4+T细胞进一步用T细胞疲劳以及激活的marker进行分群，结果表明Rab27a null、 Pd-l1 null TRAMP-C2细胞造模小鼠的T淋巴细胞被显著激活。既然肿瘤细胞是通过外泌体中的PD-L1抑制T细胞的激活，作者又提出一个假设，在外泌体缺失PD-L1的时候，免疫健全的小鼠应该不仅能够直接抑制这些基因编辑过的肿瘤细胞，也应该能够对肿瘤细胞产生记忆。为了验证这一假设，作者对C57BL6/J小鼠皮下注射Rab27a null或者 PD-L1 null TRAMP-C2细胞，90天后，对该小鼠再次注射WT TRAMP-C2细胞，有趣的是，这些小鼠上的肿瘤细胞的确没有长起来。因此，说明T细胞一旦在没有外泌体PD-L1的时候接触肿瘤抗原，他们对外泌体内PD-L1的抑制作用产生抗性（Fig. 4）。

Fig. 4

除了在TRAMP-C2模型上分析外泌体PD-L1的作用，作者还运用了另一个模型——MC38——一种结肠癌模型进行验证。MC38模型与TRAMP-C2稍有不同，该模型能够对PD-L1单抗产生部分响应。经过验证发现，Rab27a null 以及PD-L1 null细胞同样能够抑制小鼠肿瘤生长，延长造模小鼠的生存期，但是PD-L1 缺失对造模小鼠的生存期延长显著优于Rab27a缺失。说明外泌体中的PD-L1在MC38模型中仅起到部分作用，还有部分PD-L1是以外泌体非依赖的模式形式免疫抑制作用。为了验证这一结论，作用对Rab27a null细胞皮下注射小鼠，同时给予PD-L1单抗，该小鼠的存活期与PD-L1 null细胞造模小鼠无差异，这一结果说明，在MC38模型上，虽然外泌体中的PD-L1可抵抗PD-L1抗体，但是仍有部分比如膜上部分PD-L1对PD-L1抗体敏感（Fig.5）。

Fig. 5

外泌体能够由细胞分泌，进入血液和淋巴系统，可以影响远处的肿瘤细胞。那同时注射WT、Rab27a null、PD-L1 null TRAMP-C2到小鼠皮下，又会产生什么样的结果？作者在小鼠身体一侧注射WT TRAMP-C2，在另一侧注射Rab27a null或PD-L1 null TRAMP-C2细胞，结果发现与Rab27a null或PD-L1 null TRAMP-C2细胞共同注射的小鼠，WT TRAMP-C2细胞注射侧形成的肿瘤显著小于单独注射WT TRAMP-C2的小鼠肿瘤，且生存期更长。但是WT TRAMP-C2细胞对另一侧的PD-L1 null TRAMP-C2却有一定的促进肿瘤生成的作用，虽然作用比较弱，这是一个有趣的问题，这个作用的原因目前还不明确，值得探讨（Fig.6）。

Fig. 6

通过以上实验，已基本明确通过敲除Rab27a抑制外泌体分泌，或者敲除PD-L1都可以直接或者在远端解除免疫抑制，抑制肿瘤的生长。最后，作者又在小鼠皮下注射Rab27a null细胞的同时，通过尾静脉注射WT细胞或者PD-L1 null细胞来源的外泌体，发现不论是TRAMP-C2细胞模型还是MC38细胞模型，尾静脉注射WT细胞来源的外泌体，均可以抑制T细胞的激活，促进肿瘤的生长，缩短造模小鼠的存活期。

至此，一个有趣的故事讲完了，外泌体中的PD-L1可协助肿瘤细胞进行免疫逃逸，外泌体在肿瘤的发生发展过程中又罪加一等。其实在去年10月份，Nature上就有篇文献讲述了黑色素瘤细胞分泌的外泌体上携带PD-L1，可抑制CD8阳性T细胞的功能，促进肿瘤的生长。说明外泌体中PD-L1在肿瘤诊断、治疗、指导中有非常重要的作用。同时关于外泌体，我们相信还有许多有趣的故事等着研究学者们去研究发现。

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