NSMB 背靠背丨揭示微管蛋白去酪氨酸化的分子机制

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微管是真核生物细胞骨架系统的重要组成部分，在维持细胞形态和极性，调控细胞内物质和细胞器的运输，以及细胞有丝分裂等至关重要的生命活动过程中起着举足轻重的作用。微管是由α/β-tubulin 异源二聚体在GTP的作用下形成的中空管状的、具有极性的聚合体，具有一个动态的正极和相对稳定的负极【1】。微管的动态调节和功能的发挥与体内多样的微管结合蛋白（MAPs）和分子马达蛋白（motors）息息相关【2】。而且，这些MAPs和motors与微管的相互作用进一步受到不同类型的、可逆的微管翻译后修饰的调控，比如， 磷酸化、乙酰化、泛素化，以及α/β-tubulin蛋白C末端尾巴（CTT）上的多聚谷氨酰化、多聚甘氨酰化和α-tubulin蛋白CTT的酪氨酸/去酪氨酸化【3】。其中，α-tubulin蛋白的酪氨酸/去酪氨酸化修饰早在40年前就已被发现【4】，研究较为广泛。据报道，微管的酪氨酸/去酪氨酸化修饰在控制神经细胞轴突的生长【5】、有丝分裂过程中染色体向赤道板的聚集【6】和心肌细胞的收缩【7,8】等方面扮演了重要的角色。

负责α-tubulin蛋白酪氨酸化的连接酶TTL（Tubulin Tyrosine Ligase）在上世纪九十年代就已经被发现，其特异性的识别和催化游离的α-tubulin蛋白酪氨酸化的分子机制也已揭晓【9】。然而，关于微管的去酪氨酸化酶却是在近两年才被发现。2017年末，来自法国和荷兰的两个研究组分别采用不同的方法鉴定出Vasohibin1/2（VASH1/2）与SVBP的复合物是微管α-tubulin末端的去酪氨酸化酶，相应的成果以“背靠背”的形式发表于 Science 杂志【5,10】。Vasohibin最初被鉴定为一个分泌蛋白，参与调节血管的生成，其蛋白质的稳定与功能的发挥需要一个仅含66个氨基酸残基的分子伴侣蛋白SVBP（Small vasohibin-binding protein）的协助【11】。但是目前，关于VASH1/2与SVBP复合物的结构，以及其特异性的催化α-tubulin末端的去酪氨酸化的分子机制尚未可知。

2019年6月24日，美国德克萨斯大学西南医学中心、HHMI研究员于洪涛教授团队和同样来自西南医学中心的罗雪莲教授课题组合作在Nature Structural & Molecular Biology上发表题为Structural basis of tubulin detyrosination by vasohibins的文章，成功解析了高分辨率的VASH1-SVBP复合物及其与不同的抑制剂的复合体的晶体结构，揭示了VASH1-SVBP复合物特异性识别和催化α-tubulin末端的去酪氨酸化的分子机制。来自于洪涛教授团队的博士后李发祥为本文的第一作者，于洪涛教授和罗雪莲教授为论文的共同通讯作者。

在该研究中，研究人员首先纯化出VASH1/2与SVBP的复合物蛋白，进一步的体外生化实验证实：体外重组表达的复合物蛋白能够特异性的切除α-tubulin末端的酪氨酸残基(图A)。经过大量的晶体筛选，最终成功解析出衍射为2.1Å的VASH1-SVBP的复合物晶体结构。晶体结构显示：VASH1与SVBP形成一个1：1的异源二聚体，VASH1 的蛋白酶结构域折叠成一个转谷氨酸酶类似的半胱氨酸蛋白酶的构型, 具有一个N-lobe和C-lobe，以及一个NTE（N-terminal extension）区域。SVBP蛋白的主要区域折叠成一个长长的α-螺旋，并且被VASH1的NTE所包裹，从而稳定VASH1蛋白的三维结构 (图B) 。分析VASH1蛋白的催化中心发现：VASH1是一个非经典的半胱氨酸蛋白酶，其催化三联体为Cys-His-Leu， 而不是典型的Cys-His-Asp/Glu【12】。此外，所解析的VASH1-SVBP复合物与酪氨酸衍生物抑制剂epoY的共晶结构揭示了VASH1特异性的识别和切除酪氨酸和苯丙氨酸的分子机制 (图C) 。通过进一步的点突变实验证实，催化位点附近的碱性区域参与识别富含酸性氨基酸的α-tubulin尾部 (图D) ，并且这些参加催化和底物认知的关键氨基酸在VASH2中高度的保守。最后，VASH1-SVBP与来自于一种菊科植物的天然产物Parthenolide的复合物晶体结构不仅首次证明了Parthenolide抑制细胞内α-tubulin的去酪氨酸化是通过不可逆的、共价修饰VASH1 的活性位点（Cys169），并且揭示了Parthenolide特异性的识别和抑制VASH1的分子机制 (图E) ，也为进一步的开发更加高效的抑制剂提供结构基础，这些Vasohibin抑制剂有可能对治疗癌症和心脏及神经疾病有一定的价值。

在同期杂志上，南方科技大学生物系的黄鸿达副教授课题组与法国Grenoble Institut Neurosciences的Marie-Jo Moutin博士以及瑞士Paul Scherrer Institut的Michel O. Steinmetz教授团队在Nature Structural & Molecular Biology杂志上发表了题为 Structural basis of tubulin detyrosination by the vasohibin–SVBP enzyme complex 的研究论文。该项研究从结构上阐明了VASH2-SVBP蛋白复合物进行微管蛋白去酪氨酸化的分子机制。

在这篇文章中汪娜博士等解析了VASH2-SVBP复合物的晶体结构，并且通过生化和细胞实验证明了SVBP不仅能够帮助VASH2进行正确的表达和折叠，而且对于VASH2进行α微管蛋白C末端去酪氨酸化的功能也起到至关重要的作用。作者还获得了VASH2-SVBP与两种抑制剂（epoY和TPCK）的复合物晶体结构，阐明了这些抑制剂的抑制机理。作者进一步解析了VASH2-SVBP与α微管蛋白C末端的复合物晶体结构，揭示了VASH2-SVBP与α微管蛋白C末端的结合模式。并结合生化实验和神经细胞发育实验揭示了VASH2-SVBP与微管纤维的相互作用界面。

图: (a) VASH2-SVBP复合物的整体结构（卡通模型），绿色为VASH2，紫色为SVBP蛋白；(b) VASH2-SVBP（显示为静电表面模式）和微管蛋白C末端小肽（显示为球棍模型）的复合物结构；(c) VASH2-SVBP和微管蛋白C末端小肽的相互作用；(d) 检测VASH2关键氨基酸突变体的催化活性。

总的来说这篇文章报道了VASH2-SVBP进行α微管蛋白C末端去酪氨酸化的结构基础，以及其在神经细胞发育中的重要作用，并且为以后小分子抑制剂的研发提供了结构基础。

VASH1是VASH2的同源蛋白。最近黄鸿达副教授课题组还和中国科学技术大学生命学院许超教授课题组等合作揭示了VASH1-SVBP进行α微管蛋白C末端去酪氨酸化的结构基础，以及揭示了VASH1-SVBP在细胞分裂中的重要作用。黄鸿达副教授课题组的博士后汪娜为该文章的共同第一作者。该研究论文于2019年6月6日在Cell Research杂志在线发表。

黄鸿达副教授课题组的博士后汪娜、Marie-Jo Moutin课题组Christophe Bosc、Michel O. Steinmetz课题组的Sung Ryul Choi为该文章的共同第一作者。黄鸿达副教授课题组主页https://bio.sustc.edu.cn/?p=3817

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41594-019-0242-x

https://doi.org/10.1038/s41594-019-0241-y

制版人：珂

1. Dogterom, M. & Koenderink, G.H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol 20, 38-54 (2019).

2. Brouhard, G.J. & Rice, L.M. Microtubule dynamics: an interplay of biochemistry and mechanics. Nat Rev Mol Cell Biol 19, 451-463 (2018).

3. Magiera, M.M., Singh, P., Gadadhar, S. & Janke, C. Tubulin Posttranslational Modifications and Emerging Links to Human Disease. Cell 173, 1323-1327 (2018).

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