突破环境限制：使用便携式测序仪在极端环境中进行微生物宏基因组分析
宏基因组分析是指通过对单一样品中所获取的多种微生物进行基因组分析，然后对于时间较为关键或远程采样的应用，仍然存在诸如以下因素的许多挑战：
（1）样品地点：研究样品可能在实验室以外，或者条件不足的偏远地区。
（2）结果的实时性：不论是环境样品、可能包含疫情爆发证据的样品，还是识别有害物种，指导下一阶段的实地研究，获得结果的时间都很重要，因此在尽可能靠近样品源的实地进行宏基因组分析最为有利。
（3）从混合种群中鉴定和量化个别微生物：微生物混合种群基因组组装可能会比较复杂。传统DNA测序技术只能读取150-300bp的短DNA片段，对准确分析重复性基因组因子或相关物种基因组组装非常具有挑战性。
除此之外，传统测序仪器在运行结束时批量传送数据，且通常庞大笨重、不易搬运，加上大多数高通量测序仪器需由经培训的工程师精确校准，实地测序普遍缺乏配套设施和专业人员，使得这些技术难以部署在偏远地区或移动环境中。与之形成鲜明对比的是，Oxford Nanopore Technologies公司的MinION™是一种适用于实地研究的独一无二的便携式设备，不受环境的限制，能够用于实验室或者野外作业，重量不足100g，体积小到可以放在口袋里(图1)。MinION™利用笔记本电脑上的USB接口通电，可对DNA或RNA进行测序，可实现数据流的实时传送，且最快的样本测序文库准备过程仅需10分钟，每张测序芯片可以生成10-30 Gb的DNA序列数据。对于相关物种重复因子和高度保守区域，长测序读长更有助于明确鉴定和量化复杂样品中出现的物种。此外，Oxford Nanopore Technologies五月份还新发布了“Field Kit”(野外测序试剂盒)，该套装不需要冷包装运输，也不需要在一个月内使用，使得在专业实验室之外测序更加便利。
图 1. 袖珍型MinION是一种便携式测序设备，支持对复杂样品的快速实时宏基因组分析。
去年8月，南方科技大学环境科学与工程学院的夏雨教授课题组前往青海省祁连山进行高山冻土微生物群系的野外考察，探究全球变暖的环境下，祁连山冰川、冻土退化造成的微生物群落功能变化。考察期间重点对祁连山顶冰川、冻融坑和红泥沟等区域的水体、沉积物和气体等样品进行采集，同时原位提取样品中微生物总DNA并使用MinION进行测序分析。
经过对祁连山冻土微生物DNA的实地测序，初步实验结果显示，山顶（海拔3976米，土壤温度7℃）的冻融坑中微生物量丰富，而在山腰（海拔3500米，土壤温度10℃）的冻融坑中的微生物量反而较低，DNA提取相当困难，这一有趣的现象有待进一步的数据挖掘和分析，有望对认识全球变暖引起的冻土退化对微生物群落功能的影响带来新的见解。
夏雨教授表示：“在高海拔冻土退化造成的微生物群落功能变化的研究中，MinION测序仪是能最快给我们土壤微生物群落结构的测序方法，我们可以在野外工作站上就完成冻土微生物的测序和初步分析，这些及时的菌群结构解析结果可以有效的指导我们下一步的采样计划。 并且，Nanopore的长序列可以帮助我们对冻土微生物群系的宏基因组进行更有效的组装，对后续的宏转录组分析十分重要。”
“宏基因组分析是鉴定环境样品真正多样性的唯一途径。长读长和可快速实现亚种水平鉴定的MinION测序揭示了一组其他方法无法获取的新数据。”
极端环境微生物组研究项目（XMP）是一个全球科学合作项目，旨在分析极端环境微生物的特征，发现新的微生物，并针对新微生物制定新的研究流程和方案。作为XMP的成员之一，澳大利亚基因研究平台的Ken McGrath博士认为，极端环境需要不同的处理方式，极端环境微生物不同于其他微生物群落的提取。因为GC含量，他们通常更加难以测序。
西澳大利亚的希利尔湖是被XMP选作进行微生物组研究的几个地点之一，该湖水的含盐量是海水含盐量的十倍，并呈现出亮粉红色（图2），这一不寻常的颜色被认为是源自一种红色藻类（杜氏盐藻），但没有人对此进行过正式研究。
图2希利尔湖。
XMP使用了包括便携式MinION纳米孔测序仪在内的各种宏基因组技术，收集并分析了湖水和沉积物样品。该小组使用培养法发现了13种不同的微生物，使用16S扩增测序法鉴定出了其他的微生物，但是还不能解决物种水平的鉴定问题。研究小组采用MinION长读长测序，仅用2小时便可开始准确描述湖泊的实际组成，可在24小时内创建完整的系统树，包括藻类、古菌、细菌和病毒，其中许多为构成湖泊颜色的粉色（图3) ，而不是之前认为的藻类。
图3鉴定许多不同的微生物。使用KronaTools完成数据可视化。图片由Ken McGrath博士提供。
无论是冰川退缩加快，还是显著的颜色变化，微生物群落都是冰川行为的促成因素。不过，由于位置偏远、环境极端，我们对这些微生物群落还不是很了解。对于这些在物流运输上有挑战性或只能在很短的季节性时期才能进入的环境而言，能快速使用并且配有现场分析仪的便携设备显得至关重要。
Edwards博士和他的小组利用便携式MinION整合了现场测序所需的所有设备，包括DNA提取、定量、实验室制备试剂和测序与分析工具，并装入一个容量为45升、7公斤的帆布背包中，旨在建立微生物基线，帮助监测随时间而产生的环境变化。他们通过分析斯瓦尔巴特群岛高纬度北极冰川微生物区系的特点，证明了长读长纳米孔测序在极端环境宏基因组分析中的实用性（图4)。这种方法生成的数据可与传统实验室技术媲美，为多项宏基因组应用提供了机会，包括实时监测环境变化及其对微生物过程和多样性的影响。
图4. MinION能够实现真正便携的现场测序。研究高纬度北极地区微生物区系所需的所有材料和试剂可装入一个背包中。
传统测序技术的发展使宏基因组分析取得巨大进展，但依然存在许多挑战，纳米孔测序正在逐步解决这些挑战，使得宏基因组学的研究更高效实时。
如果您对在研究中使用纳米孔测序技术感兴趣，请扫描下方二维码，与Oxford Nanopore Technologies 取得联系。
参考文献
[1] Edwards, A. 使用MinION进行的宏基因组游离纳米孔测序. 网址：https://nanoporetech.com/ videos/nomadicnanopore-sequencing-metagenomes-minion（访问日期：2017年3月8日）
[2] Quick J等人 (2016). 用于埃博拉病毒监测的实时便携式基因组测序. 自然, 530(7589): 228-32
[3] Edwards, A.等人 (2016). 用纳米孔DNA测序法进行极端环境宏基因组分析：斯瓦尔巴特群岛实地报告. 78 N. bioRxiv 073965；doi：https://doi.org/10.1101/073965
[4] McGrath, K. (2016). 极端环境微生物组研究项目(XMP): 粉色湖泊之谜. 网址: https://vimeo.com/169892664【访问日期2016年10月2日】
制版人：半夏