【科学普及】《血液》：预防衰老，保护造血系统多样性是关键！

图1 血液——“青春”的源泉（图片来自网络）

使人重返“青春”的源泉，会不会是流淌在我们身体内的年轻健康血液呢？尽管这听上去仿佛是在吸血鬼小说中看到的情节那样，但的确越来越多的研究发现，年轻小鼠的血液能够改善年老小鼠的肌肉、甚至是大脑的神经和认知功能。我们不禁要问，年龄，这个神秘的“时间操纵者”，到底是怎样改变着我们机体的造血系统的呢？科学家们发现， 随着机体的衰老，血液也会发生衰老。老年人的免疫能力下降，伴随而来的是感染、癌症、免疫性疾病等发病率的增加。研究发现，老年人的血液中适应性免疫细胞比例下降，髓系的细胞比例上升，并更容易出现贫血等症状（Curr Opin Immunol., 2010）。此外，在没有其他血液系统异常的情况下，多数大于90岁以上的老年人外周血中容易出现血细胞克隆扩增的现象，即出现意义未明的克隆性造血(Clonal Hematopoiesis of Indeterminate Potential, CHIP)。同时容易伴随着DNMT3A、TET2、ASXL1、PPM1D和JAK2等基因的突变（N Engl J Med., 2014），以及心血管、白血病等疾病的高发（N Engl J Med., 2017）。目前评价衰老对造血干细胞影响的研究手段主要依赖于造血干细胞的移植（Transplantation）以及体外的实验，但移植本身会给造血干细胞带来很大的压力，并不能真实地呈现机体的造血系统状态。因此目前人们对衰老导致的在体水平造血系统的变化仍不清楚。

圣朱迪儿童研究医院（St. Jude Children's Research Hospital）的Shannon McKinney-Freeman教授和Miguel Ganuza博士（图2）近期在国际血液知名期刊Blood上发表了题为The global clonal complexity of the murine blood system declines throughout life and after serial transplantation的封面焦点文章。他们利用一种非入侵式的、在体的Cre重组酶诱导的多色标记技术体系（Confetti），描绘了不同年龄小鼠造血系统的整体克隆复杂性（Clonal Complexity）的变化（Blood，2019）。           

图2 Shannon McKinney-Freeman教授（左）和Miguel Ganuza博士（右）

Confetti小鼠，是Hugo J. Snippert等人开发出的一种报告小鼠，其在与特定的Cre小鼠杂交时，可赋予小鼠细胞“彩虹”般的颜色，用于细胞的追踪（Cell，2010）。早在2017年，Miguel Ganuza博士便利用了这种技术对血液祖细胞的频率进行了评估（Nat Cell Bio., 2017）。小鼠造血干细胞起源于胚胎期的卵黄囊和主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros， AGM)区 ，之后迁移到胎肝和骨髓。因此，研究采用了四种不同的Cre小鼠，分别为E2a^Cre小鼠（卵裂球，E1-E2）、Flk1^Cre小鼠（中胚层造血祖细胞，E7-E8）、VE^Cre小鼠（内皮造血祖细胞，E8.5-E10.5）和Vav1^Cre小鼠（成熟造血祖细胞，E11.5-E14.5），结合ROSA26^+/Confetti小鼠获得不同造血发育阶段来源的“彩色”基因小鼠（图3）。利用这种研究手段，他们发现约719个Flk⁺中胚层造血祖细胞，633个 VE-Cadherin⁺内皮造血祖细胞和545个Vav1⁺造血祖细胞分别构成了小鼠胚胎期E7-E8，E8.5-E10.5及E11.5-E14.5的造血系统。这一研究改变了人们一直认为的，仅有少量的造血祖细胞构建了哺乳动物整个生命周期造血系统的观念。

图3 不同Cre小鼠示意图（Nat Cell Bio., 2017）

延续之前的研究，作者进一步探究衰老对小鼠造血系统的整个生命周期会发生什么影响呢？有多少数量的细胞克隆在造血系统中起着关键作用，并且这些造血系统克隆随着时间的增加会产生什么样的变化呢？因此，Miguel Ganuza博士利用Confetti体系，对小鼠不同年龄阶段的造血祖细胞以及终末分化的外周血细胞的变化进行了追踪（图4）。通过对骨髓中造血祖细胞以及外周血的分析，他们发现，随着年龄的增长，造血系统整体的克隆复杂性呈现明显下降。

图4 不同Cre小鼠与Confetti小鼠配对及分析示意图

他们首先对外周血克隆的复杂性进行了分析，结果发现，16-20个月龄的小鼠保持着比较稳定的状态，在超过这个月龄的小鼠中，除了Conf-E2a^Cre小鼠，其余三组小鼠，包括：Conf-Flk1^Cre、Conf-VE^Cre和Conf-Vav1^Cre小鼠，外周血的克隆复杂性均呈现稳定的下降趋势。跟年轻小鼠比较，24及26月龄的老年小鼠外周血的克隆复杂性平均下降了24%（图5）。

图5 Conf-Flk1^Cre，Conf-VE^Cre和 Conf-Vav1^Cre 小鼠外周血的克隆复杂性随着年龄的增长下降

 那么，随着年龄的增加，骨髓中的造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell, HSC）及祖细胞又会发生什么改变呢？通过比对2月龄和26月龄小鼠造血干细胞以及多潜能造血祖细胞（Multi-Potent Progenitor, MPP）的克隆复杂性，结果发现，除了Conf-E2a^Cre小鼠，在Conf-Flk1^Cre，Conf-VE^Cre和Conf-Vav1^Cre小鼠中，绝大部分的骨髓造血祖细胞在整体水平上呈现出克隆复杂性下降的趋势（图6A）。年老小鼠的HSC及MPP的克隆复杂性分别平均下降了59.3%（P=0.045）和69.6%（P=0.053）。共同淋系祖细胞（Common Lymphoid Progenitor, CLP），共同髓系祖细胞（Common Myeloid Progenitor, CMP），和粒细胞/单核细胞祖细胞（Granulocytic/Monocytic-restricted Progenitors, GMP）分别下降了65.6%，32.3%和42.7%，而巨核细胞/红细胞前体细胞（Megakaryocytic/Erythroid progenitor, MEP）仅下降了44.2%（图6B）。有趣的是，这些数据显示随着年龄的增长，相比于其它的造血干祖细胞（HSPC），HSC和MPP对伴随年龄增加的选择压力更加敏感。

图6   小鼠骨髓造血祖细胞的克隆复杂性随着年龄的增长下降

此外，研究人员利用上述的多色标记Confetti技术对小鼠进行长达26月的在体追踪后，还将年轻的和年老的多色标记Coffetti小鼠骨髓进行连续的移植，继而以验证小鼠骨髓的造血克隆重建能力。结果发现，将年老和年轻的骨髓细胞进行连续的移植能够导致在重建的造血系统中出现以一种或者两种Confetti颜色主导的现象，即出现克隆塌陷（clonal collapse）（图7）。而且在连续移植的过程中，研究人员还发现了，跟年老骨髓比较，年轻骨髓的移植在受体鼠外周血中的扩增和重建能力显著优于年老的骨髓。这意味着，在给予造血干细胞更大压力的情况下，年老骨髓的重建能力较年轻骨髓的明显下降，且骨髓的连续移植会导致造血克隆的复杂性下降更为剧烈。

图7 年轻和年老骨髓的连续移植导致造血克隆“塌陷”

随后，研究人员对连续移植的年轻和年老的Confetti克隆进行全外显子测序（Whole-exome Sequencing）。他们在这些连续移植的造血克隆中发现了27个突变（23个错义突变，4个无义突变）。其中，有5个年老的Confetti克隆发生突变的频率接近50%。跟年轻的Confetti克隆比较，年老的Confetti克隆会发生更高的突变几率（图8）。

图8 年老的骨髓在连续的移植中积累了更多的突变

综上所述，随着年龄的增长，血液的造血克隆复杂性会大大下降，在给予更大压力的情况下——连续的造血干细胞移植，这种下降愈发明显，并且年龄增长会使得造血克隆更容易产生突变。因此，预防衰老，保护造血系统多样性减少是关键。未来能通过什么样的手段延缓造血干细胞的衰老，维持造血干细胞的克隆复杂性呢？让我们期待未来进一步深入的研究。

参考文献：

1. Ganuza M,  et al. The global clonal complexity of the murine blood system declines throughout life and after serial transplantation. Bood, 2019. 133(18): p. 1927-1941.

2. Ganuza M,  et al. Life-long hematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny. Nature Cell Biology, 2017. 19(10): p. 1153–1163.

3. Snippert HJ, et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell,  2010.143(1): p. 134-44.

4. Shaw AC, et al. Aging of the innate immune system. Curr Opin Immunol., 2010. 22(4): p. 507-5. Jaiswal S, et al. Age- related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. N Engl J Med., 2014.  371(26): p. 2488-2498.

6. Genovese G, et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. N Engl J Med., 2014. 371(26): p. 2477-2487.

7. Jaiswal S, et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. N Engl J Med., 2017. 377(2): p. 111-121.

来源：老顽童说