再创丨用薄荷醇调控治疗蛋白生产的基因开关

图1. 薄荷与薄荷醇（menthol），薄荷醇是薄荷叶片制造的一种环类单萜，也是薄荷油的主要成分。图片引自：http://essencesnatural.com/index.php?lang=tr

“夏日里凉爽的「薄荷」现在也可以作为一种开启治疗疾病开关的诱导剂。”

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实现安全精确调控基因的表达，对于未来基因治疗和细胞治疗的广泛临床应用非常关键。然而以前开发的基因开关，大部分是基于衍生于细菌或病毒的元件，比如经典的在动物实验中广泛应用的基于细菌和病毒组分的四环素（tetracycline）调控的TetR基因表达系统。然而其临床转化，因为在非人灵长类实验中观察到免疫反应而受到阻碍【1,2】。

免疫原性（Immunogenicity）是当前各种基因和细胞产品临床转化时，影响其产品的安全性（safety）和有效性（efficacy）的重要障碍，所以在开发基因或细胞产品时，应该尽量减少潜在的免疫原成分【1-3】。

2019年7月8日，苏黎世联邦理工Martin Fussenegger教授课题组与华东师范大学叶海峰课题组合作在Nature Medicine上发表文章A fully human transgene switch to regulate therapeutic protein production by cooling sensation，开发了一款完全由人体元件构成的由外部诱导剂调控的基因开关。

这项研究的挑战性在于人体细胞内各种各样的受体或元件，大部分是进化出来用于响应，监测和调节人体内部环境的，比如各种内部代谢物和信号分子。基于这些元件构建成的基因开关，就可能很容易受到人体内部因素和信号分子的干扰， 不适合构建通用的外部诱导剂调控的用以调控治疗基因表达的开关。这个元件需要尽可能对人体内部各种分子“绝缘” 又可以对外部环境中，对人体友好的分子，产生响应。本研究最终关注到存在于人体或动物皮肤中响应外部凉爽温度（无害刺激）的元件，TRPM8离子通道【4-6】。

TRPM8通道是人体或动物体内一种主要的冷感受器和薄荷醇感受器。天然物质薄荷醇（menthol）能通过食用或皮肤接触的方式给人带来凉爽感。这是由于薄荷醇（menthol）是一种TRPM8激动剂，它能活化TRPM8通道，导致神经细胞产生动作电位，并最终导致人体感受到凉爽的感觉【4-6】。

本研究基于这种冷感受器TRPM8，开发了一个薄荷醇（menthol）调控的基因开关。通过皮下移植基因工程改造细胞，并用薄荷醇（menthol）经皮肤，调控基因工程细胞，释放治疗蛋白的方式，治疗疾病。本研究将该基因开关命名为Cool_Sens。

Cool_Sens基因开关，由冷感受器TRPM8和一个响应钙离子的人工合成启动子P_NFAT3组成。薄荷醇 (menthol) 通过活化TRPM8离子通道，允许钙离子进入细胞内，随着细胞内钙离子浓度的增加，NFAT 蛋白（Nuclear factors of activated T-cells） 转入细胞核内，激活人工合成启动子P_NFAT3， 并最终驱动报告基因SEAP或治疗基因的表达（如下图，图2）。

图2. Cool_Sens基因开关信号途径示意图

在体外进行各项指标测试后，本研究对Cool_Sens基因开关进行了小鼠体内测试（图3）。经Cool_Sens基因开关改造的细胞，在被包裹进大概直径500微米左右的褐藻胶微胶囊后，被注射到小鼠皮下。然后实验人员在小鼠皮肤上涂抹一定量的含薄荷醇的自制涂膏，或者市场上的商用涂膏，比如虎标牌（Tiger balm®）万金油。通过取血测试，发现薄荷醇涂膏可以很好的经皮肤调控胶囊化细胞释放报告蛋白。

图3. 皮下注射胶囊化细胞，通过皮肤涂抹薄荷涂膏，调控胶囊化细胞释放蛋白

有一个问题，就是植入皮下的Cool_Sens细胞，会不会受到外界冷环境的影响。通过测试发现，皮肤层可以很好隔绝外界冷环境对对皮下Cool_Sens细胞的影响，甚至在对小鼠皮肤局部敷用冰袋后，也只引起血液中报告蛋白水平的轻微上升（数据见原文）。

进一步，本研究利用CoolSens基因开关分别调控表达两种治疗蛋白基因，在糖尿病小鼠模型和肌肉萎缩小鼠模型中作了测试。通过微胶囊包裹细胞，注射入小鼠皮下，然后采用经皮肤涂抹薄荷醇的方式调控治疗蛋白的释放（图3）。在两种疾病模型中均观察到了疗效。

总结：本研究成功构建了一个通过对皮肤施用薄荷醇调控治疗蛋白生产的基因开关。

这里再提一下，本研究采用的微胶囊技术是可以隔绝机体免疫细胞直接攻击胶囊内的工程化细胞，然而如果工程化细胞内有大量异体成分，这些异体成分仍然有可能扩散出微胶囊，引起周围炎症，从而危害胶囊周围人体组织和胶囊内工程化细胞【7-9】。

本文通讯作者为苏黎世联邦理工Martin Fussenegger教授，这项工作在修稿期间，得到华东师范大学叶海峰教授课题组的大力支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41591-019-0501-8

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2.  Le Guiner, C., et al. Transgene regulation using the tetracycline-inducible TetR-KRAB system after AAV-mediated gene transfer in rodents and nonhuman primates. PLoS One 9, e102538 (2014).

3. Anguela, X.M. & High, K.A. An edible switch for gene therapy. Nature Biotechnology 34, 824 (2016).

4. McKemy, D.D., Neuhausser, W.M. & Julius, D. Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 416, 52-58 (2002).

5. Peier, A.M., et al. A TRP channel that senses cold stimuli and menthol. Cell 108, 705-715 (2002).

6. Zakharian, E., Cao, C. & Rohacs, T. Gating of transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) channels activated by cold and chemical agonists in planar lipid bilayers. J Neurosci 30, 12526-12534 (2010).

7. Orive, G., et al. History, challenges and perspectives of cell microencapsulation. Trends Biotechnol 22, 87-92 (2004).

8. Kobayashi, T., et al. Immune mechanisms associated with the rejection of encapsulated neonatal porcine islet xenografts. Xenotransplantation 13, 547-559 (2006).

9. Zekorn, T.D.C., et al. Evidence for an antigen-release induced cellular immune response against alginate-polylysine encapsulated islets. Xenotransplantation 2, 116-119 (1995).

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