Nature热点 | m6A修饰促进蛋白相分离

撰文 | QY  

责编 | 兮

m6A是mRNA中最为普遍的核苷酸修饰，二代测序的结果显示，有约1/4的mRNA包含有至少一个m6A修饰位点。m6A的修饰发生在RRACH的 motif中，在mRNA的3’UTR和转录起始位点丰度较高【1,2】。m6A修饰参与了mRNA代谢的各个过程中，包括但不限于转录后剪接、翻译效率、mRNA稳定性等方面的调控【3-6】。近年来的研究显示，m6A可以影响多种细胞生物学过程，在细胞命运决定、脂代谢、 免疫等方面都起着重要的作用【7,8】。m6A的精细调控机制及其生物学功能已经成为RNA领域的研究热点。

即使m6A修饰对于细胞生物学过程的影响已经研究多年，但是对于m6A修饰如何影响这些基本的生物学过程以及如何在不同的细胞环境下发挥不同的功能这些问题一直尚未解决。

2019年7月11日，来自Cornell University 的Samie R. Jaffrey课题组在Nature上发表了题为m6A enhances the phase separation potential of mRNA的文章，报道了m6A修饰可以促进mRNA与YTHDF蛋白发生相分离从而影响了一系列的细胞生物学过程。

另外，几乎同时，庄小威实验室也在bioRxiv上online了题为m6A-binding YTHDF proteins promote stress granule formation by modulating phase separation of stress granule proteins 的文章，也报道了这一现象。

Samie R. Jaffrey实验室长期致力于mRNA转录后修饰的调节，在Nature等杂志发表了一些列高水平文章，并创建了RNA甲基化(m6A) 免疫共沉淀高通量测序 (MeRIP-Seq) 技术，从而可以在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA区域。作者在这篇文章中选取了经典的m6A结合蛋白：YTHDF1（DF1）, YTHDF2（DF2） 和 YTHDF3（DF3）作为研究对象试图揭开m6A对mRNA稳定性以及其翻译效率调控的具体机制。

对DF1, DF2 和 DF3的一级序列分析显示，三个蛋白在结构上高度保守，都含有一段约15kDa大小的用于结合m6A 的YTH结构域，以及一段约40kDa的无序区（Low complexity domain）组成（下图）。基于这一结构基础，作者推测，这三个蛋白可能会发生liquid-liquid phase separation（LLPS）现象。因此作者纯化了在细胞内含量最高的DF蛋白中的DF2蛋白。作者发现，在4摄氏度低温的环境下，DF2蛋白溶液澄清透明，当温度升高到37℃后，DF2蛋白溶液变得浑浊，当温度再次降低到4摄氏度后，溶液又变回澄清的状态，作者进一步使用不同的方法证实了DF2的这一现象为LLPS。同时也证明了在生理浓度下的DF2蛋白（约5uM）能够发生相分离现象。

作者进一步检测m6A修饰是否会在体外调节DF2蛋白的相分离过程。作者发现，带有10个m6A修饰的65nt长度的RNA能够显著促进DF蛋白的相分离现象。因此，作者推测，可能是带有m6A修饰的RNA作为骨架促进了DF蛋白的内在无序区发生相分离现象。作者进一步在细胞内检测了DF2是否能够发生相分离现象，作者发现，带有NeonGreen标签的DF2蛋白在细胞内确实能够发生相分离现象。

DF2蛋白定位于细胞内的RNA granule, P-body和Stress granule中。通常，在细胞未经历来自于环境的压力的状态下，DF2蛋白定位于细胞内的P-body以及分散在细胞质中，当细胞经历Heat shock刺激后，DF2蛋白会转位到细胞内的Stress Granule中去。基于此，作者推测，是否m6A介导的DF2蛋白的相分离现象会调节DF2蛋白以及m6A修饰的mRNA在细胞中的定位。

作者检测是否m6A调控了这一过程，作者在小鼠胚胎干细胞中敲除了METTL14后，细胞内的Stress Granule在经历Heat shock的情况下能够正常形成，但是DF2蛋白在Stress Granule中的定位显著减少（下图）。另外，不能与m6A结合的DF2的突变体，在应激状态下也不能定位到stress granule中。Stress granule中的mRNA的m6A修饰显著高于细胞内的总mRNA上的m6A修饰。也就是说，DF2在细胞应激时的stress granule的定位是依赖于其与m6A修饰的结合的，即DF2的细胞定位受到了mRNA m6A修饰的的调节。

基于以上的实验结果，作者推测，这一受到m6A修饰调控的DF2的相分离现象，可能反过来调控了带有m6A修饰的mRNA的稳定性以及其翻译效率。作者发现，mRNA的稳定性并不受到此过程的调控。因此，作者使用Ribosome Profiling技术检测了在WT以及Mettl14 KO细胞中的带有m6A修饰的mRNA的翻译效率。作者发现，在细胞没有受到Heat shock等刺激的情况下，WT以及Mettl14 KO细胞中，mRNA的翻译效率没有显著差异。但是在细胞受到Heat shock的情况下，Mettl14 KO细胞中的被m6A修饰的mRNA的翻译效率受到了明显的抑制。

基于以上的结果，作者发现了RNA的m6A修饰，特别是polymethylated mRNA能与多个DF2蛋白相互结合，显著促进DF protein的相分离现象，DF2的相分离反过来调控了polymethylated mRNA的翻译效率，为m6A修饰对于细胞生物学过程的精细调控提供了全新的理论。

这篇Nature paper于1月17日投稿到Nature，6月13日接受，7月10日online发表，在7月7日，哈佛大学庄小威实验室在bioRxiv上online了一篇题为m6A-binding YTHDF proteins promote stress granule formation by modulating phase separation of stress granule proteins（https://www.biorxiv.org/content/10.1101/694455v1）的文章，也发现了m6A的修饰能够促进YTHDF的相分离（热点领域的竞争总是残酷的）。这篇文章中，作者通过分析m6A修饰的RNA在细胞经历不同的stress条件下的亚细胞定位入手，开发了一种能够特异性m6A染色的方法，发现了m6A修饰的mRNA在细胞受到氧化应激的条件下会大量定位到Stress Granule中。作者进一步发现YTHDF对于氧化应激下Stress Granule的形成非常重要，siRNA敲低YTHDF后，在氧化应激下细胞的Stress Granule会显著减少。有意思的是在Nature paper中，明确报道了在细胞Under Heat shock压力下，METTL14的敲除不会影响Stress Granule的形成，在bioRxiv这篇文章中，抑制了YTHDF的与m6A的结合，会显著降低Stress Granule的形成。也就是说，氧化应激下形成的stress Granule与在热应激下形成的Stress Granule可能是不同的蛋白所触发，精细的机制及其调控还需要进一步的深入研究。

综上，两篇文章不同的角度出发，得出了相同的结论，即m6A的修饰可以促进mRNA与其结合蛋白共同发生相分离的过程。但是Nature paper更注重是YTHDF本身通过其YTH结构域与m6A修饰的mRNA结合，促进其IDR区域发生相分离，并通过详实的体外以及体内实验证明确实是YTHDF蛋白本身发生相分离，并且找到了发生相分离所介导的生物学功能，而庄小威实验室文章并无直接的证据表明是YTHDF本身发生的相分离，但是同样通过一些列的精细的实验，以及庄小威实验室的高效的Imaging技术揭示了YTHDF的两个domain都对于m6A促进的相分离过程的重要性，但是缺乏体外的结果以及功能实验。两篇文章用的诱导细胞压力的方式也存在一定的不同，可能也是导致有个别实验结果有一定的差异的原因。庄小威实验室将充分利用了其实验室的imaging的优势，而Samie R. Jaffrey利用了精细的生化实验以及其在m6A修饰领域建立了高通量测序手段等优势都揭示了m6A能够调控相分离现象。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1374-1

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/694455v1

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4.Meyer, K.D. and S.R. Jaffrey, The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014. 15(5): p. 313-26.

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6.Meyer, K.D. and S.R. Jaffrey, Rethinking m(6)A Readers, Writers, and Erasers. Annu Rev Cell Dev Biol, 2017. 33: p. 319-342.

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