专家点评Nature | 罗招庆/欧阳松应合作解析一种谷氨酸化修饰的新机制

点评 | 朱永群 （浙江大学生命科学研究院）

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2019年7月22日，Nature杂志在线发表了由美国普渡大学罗招庆教授和福建师范大学欧阳松应教授联合攻关的研究论文Regulationof phosphoribosyl ubiquitination by a calmodulin-dependent  glutamylase。该研究发现致病性嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）效应蛋白SidJ可以被宿主体内的一个钙调蛋白Calmodulin（简称CaM）结合并激活，进而通过谷氨酸化修饰（Glutamylation）抑制SidE家族泛素连接酶活性的分子机理【1】。该工作详细解析了致病性嗜肺军团菌效应蛋白SidJ调控SidE酶活性的分子机制，为探讨谷氨酸修饰酶（glutamylase）的催化机制提供了新的体系，也为临床治疗嗜肺军团菌感染的药物开发提供了新靶点。

嗜肺军团菌是一种引起人的非典型性肺炎的条件性致病菌, 其通过IV型分泌系统Dot/Icm分泌300多个效应蛋白到宿主细胞中，调控干扰宿主各种信号通路以辅助其自身在宿主细胞内的增殖。对这些效应蛋白的功能解析不仅有助于阐明了嗜肺军团菌侵染宿主的分子机理，同时也能揭示新的细胞信号传导方式和蛋白质翻译后修饰模式【2】。众所周知，泛素化修饰几乎调控真核细胞的生命活动的所有方面【3】。在与宿主的长期博弈过程中，病原菌进化出了多种方式来干预宿主的泛素修饰系统，从而达到增强侵染效率和逃避宿主免疫监视的目的。2016年普渡大学罗招庆教授课题组在Nature杂志上首次报道了SidE家族效应蛋白独立于经典的E1和E2酶的泛素化修饰的重大发现【4】，引发了广泛关注【5-7】，该发现入选为当年度细胞信号传递领域的重大突破之一【8】。后续研究发现嗜肺军团菌中的另一个效应蛋白SidJ可调控SdeA等SidE家族成员（罗招庆组揭示独特的细菌去泛素化酶可逆转磷酸核糖连接的泛素化）【9】，但其生化机制尚未清楚。

针对这一重要科学问题，中美两国研究人员进行了联合攻关。首先，通过质谱（LC-MS/MS）分析，发现SidJ诱导失活的SdeA发生129.01道尔顿的分子量漂移。进一步研究发现，SidJ能对SdeA进行谷氨酸化修饰，且 SdeA 被修饰的位点是位于其mART结构域中860位的谷氨酸残基上，该位点是SdeA mART结构域催化的活性位点之一，主要负责水解NAD＋，为泛素激活提供能量。更为有趣的是，研究者通过对SidJ序列分析，发现SidJ的C端具有一个结合CaM的保守IQ 结构域，CaM与SidJ结合形成稳定复合物，进而激活其酶活性（图1）。

图1 SidJ通过C端I841Q842 motif与CaM结合从而谷氨酸化SdeA

随后研究人员解析了SidJ-CaM二元复合物以及SidJ-CaM结合AMP的三元复合物晶体结构（图2），惊奇地发现SidJ的结构与在已知的真核生物中行使谷氨酸化修饰功能的tyrosineligase-like（TTLL）家族酶完全不同【10】。结构解析显示CaM能够通过N-lobe和C-lobe与SidJ存在广泛的结合。

图2 SidJ-CaM（PDB：6K4K）以及SidJ-CaM-AMP（PDB：6K4R）的晶体结构结构及不同的ATP类似小分子对其激活的能力

另外，SidJ-CaM复合体结合一个AMP残基，揭示SidJ是在α位磷酸切割ATP，从而通过酰化单磷酸腺苷化激活被修饰位点的谷氨酸残基，异于常见的磷酸化激活。因此，g 位不能水解的类ATP分子仍能支持其活性。同时，在没有SdeA的反应体系里，SidJ能发生AMP自修饰（self-AMPylation），进一步说明该反应由两步特异的修饰完成（图2）。在没有受体基团的条件下，SidJ将源于ATP的AMP用于自修饰。综合现有的研究结果，研究人员提出了SidJ结合宿主CaM催化SdeA的谷氨酸化修饰，进而导致SdeA失活的分子机制（图3）。

图3 SidJ-CaM通过形成酰化单磷酸腺苷反应中间物催化谷氨酸化的反应模型。

谷氨酸化修饰此前多见于真核细胞微管蛋白（Tubulin）的修饰，并调控多种重要细胞功能，但是其催化机理如底物识别等机制并不是非常清楚【10,11】。SidJ作为一个CaM依赖的谷氨酸化酶为进一步探讨这一家族酶的作用机制提供了一个窗口。该工作是由美国普渡大学罗招庆教授课题组和福建师范大学欧阳松应教授课题组合作完成的。罗招庆教授和欧阳松应教授为本文的共同通讯作者，普渡大学罗招庆教授课题组博士生干宁海、福建师范大学生命科学学院青年教师甄向凯博士、普渡大学刘尧、以及福建师范大学南方生物医学研究中心一年级硕士生许小龙为共同第一作者。

据悉，Nature同期还以背靠背的方式刊登了德国歌德大学（Goethe University）Ivan Dikic教授课题组的研究论文Inhibitionof SidE ubiquitin ligases through SidJ/Calmodulin catalyzed glutamylation【12】。

此外，不久前美国西南医学中心的研究人员在Science上也发表了类似的研究结果【13】。

朱永群（浙江大学生命科学研究院，教授）

2016年罗招庆教授课题组在Nature上发表文章，发现嗜肺军团菌SidE家族效应蛋白SdeA、SdeB、SdeC以及SidE能够以NAD为能量源，通过生成ADP-核糖基化(ADP-ribosylation)的泛素作为中间体，进行独特的蛋白质泛素化作用，从而首次提出E1和E2非依赖的蛋白质泛素化的全新概念。随后Ivan Dikic教授在他们工作的基础上，通过生化研究，以及Ralph Isberg教授通过细菌感染等实验，发现这种E1和E2非依赖的泛素化是SidE家族效应因子通过PDE（磷酸二酯酶）结构域，在其ADP核糖基转移酶结构域催化ADP-核糖基化泛素中间体的基础上，对激活的泛素（ADPR-Ub）进行切割，并将磷酸核糖基化的泛素共价连接到底物的丝氨酸残基上。这些研究改变了人们对蛋白质泛素化催化中三酶机制的传统观念。

然而在SidE家族基因座中间存在一个SidJ基因。2007年罗招庆教授首先克隆出SidJ基因，并发现其对嗜肺军团菌的胞内生存具有重要作用。随后在2015年，Craig Roy教授以及Joseph Vogel教授都发现了SidJ能够抑制SidE家族效应蛋白对酵母细胞的毒性作用，表明细菌本身存在对这些泛素连接酶功能的调节，然而其中的机制并不清楚。在这项研究中，罗招庆教授课题组首先通过酵母毒性实验，发现SidJ抑制SdeA的ADP-核糖基转移酶酶的活性，然后通过质谱测定，发现SidJ是一个独特的谷氨酸化酶，对SdeA的ADP-核糖基化转移酶结构域中的活性氨基酸残基E860进行了一种不常见的谷氨酸化修饰，修饰后的SdeA丧失了ADP-核糖基化转移酶活性，故而不能进行随后的E1和E2非依赖的泛素化反应。他们早在2011年时就通过对SidJ序列分析发现SidJ能够结合真核生物所特有的钙调蛋白，但其结合的生物学意义一直不清楚。在确认SidJ可能谷氨酸化修饰SdeA后，他们通过生化实验，发现钙调蛋白的结合激活了SidJ的谷氨酸化酶活性。通过与福建师范大学的欧阳松应教授合作，成功解析了SidJ与钙调蛋白以及AMP的不同复合物的晶体结构，发现SidJ可能通过腺苷单磷酸化作用对SdeA进行谷氨酸化修饰的全新酶学机理。

这项研究首次发现病原菌效应蛋白具有独特的谷氨酸化酶学活性，揭示了病原菌利用本身蛋白和真核生物特有分子对细菌的感染过程进行精确调节的新机制，也促进了人们对多见于对真核细胞微管蛋白修饰的谷氨酸化修饰的催化机制的新认识。另外，Ivan Dikic教授直接通过真核共表达和质谱鉴定的方法，以及西南医学中心的Vincent S. Tagliabracci助理教授从生物信息学、分析SidJ假激酶结构域的角度入手，获得了相似的发现，说明了多学科交叉非常有利于从不同角度去全面地认识同一生物学现象及其分子机制。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1439-1；

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1440-8

制版人：小娴子

1   Ninghai Gan, Xiangkai Zhen, Yao Liu, XiaolongXu, Chunlin He, Jiazhang Qiu，Yancheng Liu, Grant M.Fujimoto, Ernesto S. Nakayasu, Biao Zhou, Lan Zhao, Kedar  Puvar, Chittaranjan Das, Songying Ouyang,Zhao-Qing Luo. Regulation of phosphoribosyl ubiquitination by a calmodulin-dependent  glutamylase Nature (2019). DOI:10.1038/s41586-019-1439-1

2   Qiu,J. & Luo, Z. Q. Legionella and Coxiella effectors: strength in diversityand activity. Nat Rev Microbiol 15, 591-605,doi:10.1038/nrmicro.2017.67 (2017).

3   Komander,D. & Rape, M. The ubiquitin code. Annualreview of biochemistry 81,203-229, doi:10.1146/annurev-biochem-060310-170328 (2012).

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7   DuToit, A. Bacterial pathogenesis: Bacterial effectors skip a few steps. Nat Rev Microbiol 14, 331, doi:10.1038/nrmicro.2016.61 (2016).

8   Adler,E. M. Signaling Breakthroughs of the Year. Sci Signal 9, eg1,doi:10.1126/scisignal.aad9795 (2016).

9   Qiu,J., Yu, K., Fei, X., Liu, Y., Nakayasu, E. S., Piehowski, P. D., Shaw, J. B.,Puvar, K., Das, C., Liu, X. & Luo, Z. Q. A unique deubiquitinase thatdeconjugates phosphoribosyl-linked protein ubiquitination. Cell Res 27, 865-881,doi:10.1038/cr.2017.66 (2017).

10  Rogowski,K., van Dijk, J., Magiera, M. M., Bosc, C., Deloulme, J. C., Bosson, A., Peris,L., Gold, N. D., Lacroix, B., Bosch Grau, M., Bec, N., Larroque, C., Desagher,S., Holzer, M., Andrieux, A., Moutin, M. J. & Janke, C. A family ofprotein-deglutamylating enzymes associated with neurodegeneration. Cell 143, 564-578, doi:10.1016/j.cell.2010.10.014 (2010).

11  O'Hagan,R., Silva, M., Nguyen, K. C. Q., Zhang, W., Bellotti, S., Ramadan, Y. H., Hall,D. H. & Barr, M. M. Glutamylation Regulates Transport, SpecializesFunction, and Sculpts the Structure of Cilia. Curr Biol 27, 3430-3441e3436, doi:10.1016/j.cub.2017.09.066 (2017).

12  SagarBhogaraju, F. B., Rukmini Mukherjee, Michael Adams, Moritz M.  Pfleiderer, Wojciech P. Galej, VigorMatkovic, Sissy Kalayil, Donghyuk Shin, Ivan Dikic,. Inhibition of SidE ubiquitin ligases through SidJ/Calmodulincatalyzed glutamylation Nature(2019).

13  Black,M. H., Osinski, A., Gradowski, M., Servage, K. A., Pawlowski, K., Tomchick, D.R. & Tagliabracci, V. S. Bacterial pseudokinase catalyzes proteinpolyglutamylation to inhibit the SidE-family ubiquitin ligases. Science 364, 787-792, doi:10.1126/science.aaw7446 (2019).