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《Mater.Horiz.》电荷调控实现荧光探针对细胞膜或线粒体的选择性识别

科界 2019-07-26

来源:高分子科学前沿

对生物细胞内部各细胞器的高分辨可视化是了解生命过程、诊断病因和研究药物效应动力学的关键。近期发展迅速的荧光探针是实现此目标的绝佳选择,因为它具有高度的灵敏性、响应快、易操作且可原位检测。目前,具有聚集诱导发光(AIE)效应的荧光分子,由于其在多方面的优势(如在很宽浓度范围内可发光、聚集态荧光效率高、光稳定性好以及较大的Stokes位移),而被应用于染细胞膜、细胞质、溶酶体、液滴、线粒体及RNA等。然而,用于细胞成像且具有AIE特性荧光探针的设计需要优化多方面的因素(如荧光发射波长、穿膜能力、可溶性和稳定性等),且这些因素间紧密相关,不能够单独优化,这使得合理设计生物荧光探针非常具有挑战性。从实验角度讲,由于时间和空间分辨率的限制,在分子层次上荧光探针识别特定细胞器的内在机制尚不清楚,目前荧光探针的探索和发现主要通过昂贵的试错法,而且荧光分子结构对于不同的生物环境高度敏感。因此,为实现高效和精确生物荧光探针的设计,在分子水平上揭示其识别细胞中不同细胞器的内在机制非常关键。通过分子模拟的手段在分子层次上研究荧光探针的内在工作机制,揭示其材料结构与性能间的关系,以提出荧光探针材料设计的新策略迫在眉睫。

北京理工大学的郑小燕副研究员、深圳大学的王东副教授、中国科学院化学所彭谦副研究员与香港科技大学唐本忠院士团队合作,通过将大尺度分子动力学模拟与量子力学和分子力学方法相结合,在分子水平上,系统研究了两种代表性具有AIE特征且结构相似的两亲性荧光探针TTPy和TTVP可分别选择性“点亮”线粒体和细胞膜的内在机理,并提出设计具有AIE特性的荧光探针以选择性识别细胞膜和线粒体的新策略。基于此新策略的提出,他们设计并合成了四种新的AIE材料,经过AIE材料的染色定位测试,所设计AIE分子的细胞成像实验结果与理论预测完美吻合。

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图1. (a)TTPy和TTVP的分子结构。(b)磷脂双层膜结构和密度图。其中磷脂双分子层被分为四部分(用I,II,III和IV表示)。(c)和(d)计算所得两分子的穿膜系数和自由能曲线。

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图2. TTPy和TTVP在磷脂膜中的快照。(a)TTPy位于自由能最小点z = 12 Å;(d)TTPy处于膜中心z = 0 Å;(g)TTVP位于其自由能最小点z = 14 Å;(j)TTVP位于膜中心。疏水的TTV基团、吡啶基和季铵盐分别用绿色、黄色和紫色显示。(b,e, h, k)显示对左侧快照局域放大的快照,其中AIE分子周围10 Å的水分子也显示出来。(c, f, i, l)纯磷脂膜及嵌入AIE分子的磷脂膜中磷酸基团的分布图。其中磷脂层的厚度用dP-P表示。

如图1a所示,TTPy和TTVP都属于两亲性分子且具有相同的疏水基团,简称TTV(绿色),唯一的不同在它们的亲水部分,TTPy亲水部分是带一个单位正电荷的吡啶基,而TTVP的亲水部分则是带两个单位正电荷(包含一个吡啶基和一个季铵盐)。通过大尺度的分子动力学模拟,他们发现TTPy和TTVP的穿膜系数分别为:7.685 cm/s和3.612 × 10-2 cm/s(图1c),也就是说理论预测TTPy的穿膜能力是TTVP的213倍。两个分子结构相似,而穿膜能力差别如此之大的原因,可通过两分子穿膜过程所对应的自由能曲线来解释。如图1d所示,TTPy和TTVP的自由能最小点(-28.73 kJ/mol和-15.63 kJ/mol)都位于细胞膜的亲疏水交界处,说明两分子都具有两亲性。另外,在细胞膜的疏水中心,由于两亲性分子的亲水端对疏水环境的排斥,亲水区域带正电荷的两亲性分子会吸引磷脂膜表面带负电荷的磷酸基团,从而引起磷脂双分子膜的明显形变,同时伴随水分子进入磷脂膜的疏水区域(图2),而使得TTPy和TTVP在细胞膜中心都存在明显的自由能势垒,分别为19.04 kJ/mol和30.44kJ/mol(图1d)。很明显,亲水部分带两个单位正电荷的TTVP在细胞膜中心的自由能垒明显高于TTPy(亲水头部只带有一个单位正电荷),这也是TTVP比TTPy穿膜能力差的本质原因。通过计算,我们揭示了实验上TTVP选择性“点亮”细胞膜,而TTPy可以穿透细胞膜的微观机制。

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图3.(a)TTVP在细胞膜中的QM/MM计算模型。(b, c)计算所得TTVP在细胞膜和THF溶液中激发态所对应的自然跃迁轨道 NTOs。(d, e)TTVP在细胞膜和THF溶液中基态和激发态优化结构重叠图。计算所得TTVP分子在细胞膜和THF溶液中(f)总重整能和(g)荧光光谱。

为了进一步解释两种分子在细胞器中成像的AIE机理,他们在大尺度分子动力学模拟的基础上,进一步建立TTVP分子在细胞膜和稀溶液两种环境下的QM/MM模型(图3a)。计算发现,在稀溶液和细胞膜两种环境下,TTVP分子S1态所对应的自然跃迁轨道都主要分布在TTV和吡啶环上,而在季铵盐上没有任何分布,所以TTVP的发光性质主要由TTV基团和吡啶基来决定,而与季铵盐基团无关。相对于稀溶液来说,TTVP分子在细胞膜环境下具有更强的刚性,其自然跃迁轨道的离域范围更大,具有更大的跃迁偶极矩(图3b-c)。在细胞膜中TTVP分子基态和激发态结构间的差别更小(图3d-e),具有更小的重整能(图3f),因此在细胞膜中TTVP的发射光谱相对稀溶液中也发生蓝移(图g)。除此之外,他们还计算了TTVP分子在稀溶液中的辐射跃迁速率常数(kr)和非辐射跃迁速率常数(knr),其值分别为3.3 × 108s-1和2.4 × 1010 s-1,则其对应的荧光量子产率只有1.3%,因此解释了实验上TTVP分子在稀溶液中不能发光的事实。他们还发现TTVP分子在细胞膜中的辐射跃迁速率常数稍大于稀溶液中对应的值,约为3.6 × 108 ~ 3.7 × 108 s-1。由于目前计算能力的局限性,TTVP在细胞膜中的无辐射跃迁速率常数无法得到,但是根据以往对有机小分子AIE机理的认识,他们推测TTVP在细胞膜中的无辐射跃迁速率常数会比稀溶液中小的多,因为它的重整能很小,所以TTVP能够“点亮”细胞膜。

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图4.(a)通过理论计算提出AIE分子的设计原则。(b-e)理论设计的四种AIE分子。

通过多尺度的分子模拟手段对TTPy和TTVP两代表性两亲性AIE体系不同细胞成像机理的系统研究,他们提出了设计新型AIE分子以选择性识别细胞膜和线粒体的新策略。如图4a所示,此荧光探针需要具有两亲性,其疏水部分是具有AIE特征的发光基团,而亲水部分则是带有不同电荷的季铵盐。疏水部分的AIE基团可以决定其在细胞器中发光的颜色,而亲水部分的带电量则可以控制AIE分子穿透细胞膜的能力。基于此设计原则,他们设计并合成了四种AIE分子:TPEPy,TPy,TPEVP和TVP(图4b-e),其中TPEPy和TPy与TTPy具有相同的亲水部分,应该可以穿过细胞膜,“点亮”线粒体;而TPEVP和TVP与TTVP具有相同的亲水部分,可以直接“点亮”细胞膜。

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图5. AIE材料的染色定位测试。HeLa细胞经(a)TPEPy、(b,f)MitoTracker Green、(e) TPy、(i)TPEVP、(j,n)Cellmask Green、(m)TVP染色的的共聚焦成像。(c, g, k, o)分别表示由(a)和(b),(e)和(f),(i)和(j)以及(m)和(n)两两合并之后共聚焦图像。(d,h,l,p)明场。浓度:TPEPy和TPy (1 μM), TPEVP和TVP (1 μM), MitoTracker Green (50 × 10−9 M),和Cellmask Green (2.5 μg/ml)。所有AIE分子的激发波长 405 nm, MitoTracker Green和Cellmask Green的激发波长是488 nm。所有AIE分子发射波长收集区间为:600-744 nm,而Cellmask Green和MitoTracker Green所对应的发射波长收集区间分别为: 490–600 nm和490-580 nm。

为了进一步验证理论预测,他们对四种设计的AIE分子进行了染色定位测试。实验结果发现,与理论预测一致,TPEPy和TPy可以穿过细胞膜,“点亮”线粒体;而TPEVP和TVP可以直接“点亮”细胞膜。

该研究的最大意义在于,通过理论计算提出了设计新的生物荧光探针的新策略,而且此新策略经实验验证效果非常好,为实验上设计新的AIE体系以选择性定位细胞膜和线粒体非常有益,可以简化实验流程,大大降低实验成本。

参考文献:

Xiaoyan Zheng,Dong Wang, Wenhan Xu, Siqin Cao, Qian Peng, Ben Zhong Tang. Charge Control of Fluorescent Probes to Selectively Target Cell Membrane orMitochondria: Theoretical Prediction and Experimental Validation. MaterialsHorizons. 2019, DOI: 10.1039/C9MH00906J.

文章链接:

https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2019/mh/c9mh00906j#!divAbstract

细胞膜 荧光探针

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