华中师范大学杨光富团队解析首例HPPD与其天然底物的复合物晶体结构 | SPJ专递

研究背景

作为一种亚铁依赖性的非血红素加氧酶，对羟基苯基丙酮酸双氧化酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD）位于酪氨酸的代谢途径上，可将对羟苯基丙酮酸（4-hydroxyphenylpyruvate, HPPA）转化为尿黑酸（2,5-dihydroxyphenylacet ate, HGA）如图1所示。

图1  酪氨酸在植物和人体中的代谢途径

在植物体中，一旦HPPD的活性被抑制，则质体醌和生育酚的正常合成途径将被阻断，进而造成类胡萝卜素的生物合成减少、光合作用中的电子传递链受阻，以及质体的光氧化等多种现象；在人体中，酪氨酸的代谢异常也会导致黑尿病和I型酪氨酸血症。因此，HPPD既是医药分子的作用靶标，也是重要的除草剂作用靶标。由于目前已知的HPPD抑制剂都属于底物竞争型抑制剂，所以底物HPPA在HPPD中的结合模式对于理解酶催化反应机理和新型抑制剂的设计均具有重要意义。然而，文献报道的三种底物结合模式都是基于一定的实验结果而推测的，缺乏直接证据。因此，获得HPPD与其天然底物的复合物晶体结构对于研究HPPD的催化机理以及新型抑制剂的分子设计具有极其重要的理论与实际意义。

研究进展

该团队解析了第一个HPPD与天然底物HPPA的复合物晶体结构，如图2所示。其中图2（A）为AtHPPD-HPPA单体的结构，图2（B）为HPPA在AtHPPD活性腔中的结合模式，图2（C）为AtHPPD-HPPA（主链和侧链用蓝紫色表示）与holo-AtHPPD（主链和侧链用黄色表示）结构叠合比较，红色箭头表示构象差异较大的氨基酸残基，图2（D）为AtHPPD-HPPA结构中Gln293的电子云密度图和活性腔中的氢键网络。 

图2   AtHPPD-HPPA复合物晶体结构及其与holo- AtHPPD结构的比较

在AtHPPD-HPPA复合物晶体结构中，HPPA的α-酮酸部分与活性中心的金属离子形成双齿配位，酚羟基的氧原子与Asn423形成氢键，苯环部分与Phe381之间存在T-π疏水相互作用。将该复合物晶体结构与未结合配体的holo-AtHPPD晶体结构（PDB编号：1SQD）进行比较（图2A和B）可以发现，当HPPA与HPPD结合时，Asn423的侧链发生了构象变化并与HPPA的酚羟基形成氢键相互作用（距离~ 3.2 Å）；Gln293的侧链也发生了偏转并与Gln307形成氢键相互作用（距离~ 3.5Å）（图2C），而在holo结构中，Gln293与Gln307的距离为5.1 Å。根据文献报道，Gln307，Ser267和Asn282组成的氢键网络对于HPPD的催化过程起着重要作用，而当HPPA结合在活性腔之后，Gln293也参与到了这一氢键网络的之中（图2D）。

他们进一步通过定点突变实验发现，当Gln293突变成丙氨酸后，其kcat/Km值相较于野生型HPPD降低了约3700倍。这一结果充分表明Gln293在酶催化反应过程中起着重要作用。随后，他们将HPPA结合后的Gln293的构象定义为“活化构象”，将未结合底物时Gln293的构象定义为“非活化构象”。鉴于Gln293在底物HPPA结合前后的构象变化对于稳定底物及酶催化反应均具有重要意义，他们提出了靶向Gln293构象变化的分子设计策略。即，设计一种抑制剂来阻止Gln293从“非活化构象”向“活化构象”转变，那么HPPD就无法对底物HPPA进行有效结合，酶催化反应自然也就无法进行。

按照上述策略，他们利用前期研究中建立的农药与医药活性碎片库PADFrag，开展了新型HPPD抑制剂的合理设计。首先，他们将PADFrag中的碎片与三酮药效团进行连接，建立了一个包含15,235个化合物的虚拟分子库；随后通过对该分子库进行虚拟筛选获得了苗头化合物（图3）。

图3  新型HPPD抑制剂虚拟筛选的流程

通过多种属酶抑制动力学、温室除草活性筛选以及田间药效试验，他们发现多个苗头化合物，尤其是化合物Y13161具有良好的酶抑制活性（Ki,AtHPPD = 24.10 ± 0.30 nM）和高效除草活性（在105~150克/公顷的剂量下对阔叶杂草及部分禾本科杂草表现出优异的防效）。尤其值得说明的是，Y13161对野糜子和狗尾草这两种高粱及玉米地极难防治的重要杂草具有卓越的防效，并且对高粱、玉米、小麦、甘蔗等多种作物表现出优异的作物安全性。此外，由于Y13161具有良好的种属选择性（对人源HPPD的活性较低，Ki = 179.0 ± 7.70 nM），因而表现出良好的毒理学性质，其对哺乳动物以及蜂、鸟、鱼、蚕等环境生物均为低毒。目前，Y13161被国家农药标准化技术委员会命名为喹草酮，由山东先达农化股份有限公司开展新农药登记，各项试验进展顺利，预计2020年初可取得正式登记。需要指出的是，迄今为止全世界尚没有可用于高粱地的选择性除草剂，而喹草酮对高粱表现出高度安全性。因此，喹草酮取得登记并进入市场后，有望成为全球第一个高粱地选择性超高效除草剂，从根本上解决长期制约高粱产业发展所面临的杂草防治这一关键技术难题。

为了验证分子设计思路，他们还成功解析了喹草酮与AtHPPD复合物的晶体结构（图4）。图4（A）为Y13161在AtHPPD活性腔中结合模式，图4（B）为Y13161在AtHPPD活性腔中结合模式的表面图，图4（C）为AtHPPD-Y13161（红色）与holo-AtHPPD（黄色）结构叠合比较图，图4（D）AtHPPD-Y13161（红色）与AtHPPD-HPPA（紫色）结构叠合比较图，氢键相互作用用黑色虚线表示。

图4  Y13161与AtHPPD复合物晶体结构分析

晶体结构解析表明，喹草酮包含的喹唑啉二酮分子片段中二甲基取代的苯环侧链与Phe392、Met335以及Leu368和Leu427均形成了有效的疏水相互作用。值得一提的是，该化合物的晶体结构与不含配体的HPPD结构重叠的非常好，显示喹草酮的结合模式中Gln293侧链的构象确实处于“非活化构象”，与holo-AtHPPD结构中的构象几乎完全一致。

未来展望

首例HPPD与其天然底物的复合物晶体结构的解析，为进一步深入研究HPPD的催化反应机理奠定了坚实的结构基础。另外，靶向Gln293构象变化的分子设计策略的提出以及喹草酮的成功发现，既为新型HPPD抑制剂的研究提供了重要思路，也为基于靶酶关键残基构象变化的药物或农药设计提供了一个普适性的方法。

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