Cell | UBQLN4在DNA损伤修复中的作用

赤贞 BioArt

撰文 | 赤贞

责编 | 迦溆

在泛素-蛋白酶体降解途径中，被泛素化的蛋白底物经由蛋白酶体的特定亚基识别、介导降解。此外，一些穿梭蛋白（shuttle factors）也可以介导蛋白酶体对泛素化底物的识别。在芽殖酵母中，这些穿梭蛋白主要有Dsk2、Rad23、Ddi1，三者均参与到DNA损伤修复的不同阶段中【1】。Dsk2在哺乳动物中的同源蛋白为泛醌蛋白ubiquilin，由UBQLN基因编码，包含ubiquilin1、ubiquilin2、ubiquilin4三种。其主要结构域为泛素样结构域（UBL）、泛素结合结构域（UBA）。Rad23、Ddi1在DNA损伤修复中的角色已被详细报道过【2】，而Dsk2/UBQLN是否参与到DNA损伤修复过程中、其作用为何尚无定论。

近期，Cell 杂志以UBQLN4 Represses Homologous Recombination and Is Overexpressed in Aggressive Tumors为标题在线发表了以色列特拉维夫大学和德国科隆大学、洪堡大学等多家研究机构合作得出的研究成果。该研究以一个UBQLN4突变家系为入手点，对UBQLN4在DNA同源重组修复过程中的作用进行了细致的描述，并对其在恶性进展期癌症中的作用进行了探讨。

研究团队在两个具有血缘关系的家系中发现了两位基因组不稳定综合征患者，均带有纯合的UBQLN4基因976位C>T突变，该突变导致ubiquilin4蛋白第326位精氨酸突变为终止密码子。这一突变使得患者细胞内的UBQLN4 mRNA水平降为正常人的1/3，ubiquilin4蛋白的全长表达低于检测下限。因此，这一突变导致了患者体内ubiquilin4蛋白的缺失。

研究团队在前期的RNAi筛选中发现，在U2OS细胞内敲低UBQLN4会大大增加细胞对DNA损伤试剂如HU、etoposide、cisplatin、NCS的敏感性，效果仅次于ATM抑制剂KU60019，而回转全长UBQLN4则可逆转这一现象。从患者体内分离出来的皮肤成纤维细胞也表现出了相同的高敏感性。由此，研究者猜想UBQLN4可能通过参与DNA损伤修复影响细胞对于DNA损伤的敏感性。免疫荧光实验发现，UBQLN4 c.976C>T突变细胞在经HU处理后，γH2AX foci的数量、持续时间均显著上调（图1），且这一现象在S期晚期尤为显著。作者还通过中性彗星分析实验进一步验证了UBQLN4缺失的细胞中双链DNA断裂水平显著高于正常细胞，表明UBQLN4缺失的细胞中DNA损伤修复机制明显受损。

图1. UBQLN4 c.976C>T突变细胞经DNA损伤试剂处理后，γH2AX foci的数量、持续时间均显著上调。

然而，UBQLN4究竟是如何参与到DNA损伤修复过程中的？2007年，哈佛医学院Steven P. Gygi和Stephen J. Elledge教授的研究团队曾通过大规模磷酸化蛋白质组学对DNA损伤修复过程中ATM、ATR的主要底物进行分析【3】，文章发表在Science 杂志上，而本研究的通讯作者之一Yoself Shiloh教授即为该篇Science的作者之一。该分析发现UBQLN4第318位丝氨酸位点在离子辐射后可被磷酸化。由于第318位丝氨酸刚好位于肽段S-S-Q-P中，后者为ATM的典型底物motif，研究者即对这一现象进行了实验验证。经离子辐射处理后的U2OS细胞，其pS318/UBQLN4水平在30分钟左右达到高峰，且可持续4-6小时；UBQLN4缺失的细胞或UBQLN4S318A细胞则无此现象。并且，离子辐射或DNA损伤试剂诱导的pS318/UBQLN4水平仅能被ATM抑制剂KU60019抑制，ATR抑制剂AZ20、DNA-PK抑制剂KU60648对pS318/UBQLN4水平无影响。这表明UBQLN4第318位丝氨酸的磷酸化是在DNA损伤时、在ATM的催化下产生的。此外，研究者还证明了UBQLN4第318位丝氨酸的磷酸化是影响细胞DNA损伤修复机制的主要原因。

进一步，研究者尝试探究UBQLN4究竟参与到DNA损伤修复的哪一个环节当中。研究者通过SeeSaw reporter system、DR reporter assay、免疫荧光实验发现，UBQLN4缺失的细胞倾向于通过同源修复（HRR）来完成双链DNA损伤的修复，而UBQLN4高表达的细胞则更倾向于非同源性末端接合（NHEJ）途径。此外，在DNA损伤时，UBQLN4与HRR过程起始阶段所必须的核酸酶MRE11有非常强的相互作用。因此，作者推测，UBQLN4通过介导HRR过程中主要蛋白的降解，抑制HRR途径，从而影响细胞对DNA损伤修复途径的选择。其具体机制为：在DNA损伤时，UBQLN4缺失将导致MRE11在损伤处的停留时间显著延长，后者的主要形式是被泛素化的MRE11（图2）。这表明UBQLN4的缺失导致蛋白酶体不能够及时有效地清除多余的MRE11。MRE11在DNA损伤处的长时间停留导致DNA损伤修复途径向HRR倾斜，这一现象可被MRE11抑制剂Mirin和PFM01扭转。

图2. UBQLN4缺失导致泛素化的MRE11在DNA损伤处堆积。

UBQLN4的过表达则可以明显加强细胞的DNA损伤修复能力，从而保护细胞免受DNA损伤如NCS的毒害。此外，作者还发现在晚期神经母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌及卵巢癌患者中，UBQLN4的高表达与不良预后显著相关。由于UBQLN4通过抑制HRR途径、诱导DNA损伤修复向NHEJ途径倾斜，因此UBQLN4高表达的细胞对PARP1抑制剂如奥拉帕尼的敏感性显著上升。这一效果类似于BRCA1/BRCA2突变导致的同源修复缺陷与PARP1抑制剂对肿瘤细胞的合成致死效应。

图3. UBQLN4影响DNA损伤修复途径的选择

图4. 患儿临床表现

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.11.024

参考文献

1. Hartmann-Petersen, R., et al. (2003). "Transferring substrates to the 26S proteasome." Trends Biochem Sci 28(1): 26-31.

2. Kaplun, L., et al. (2005). "The DNA damage-inducible UbL-UbA protein Ddi1 participates in Mec1-mediated degradation of Ho endonuclease." Mol Cell Biol 25(13): 5355-5362.

3. Matsuoka, S., et al. (2007). "ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage." Science 316(5828): 1160-1166.

4. Ng, J. M., et al. (2003). "A novel regulation mechanism of DNA repair by damage-induced and RAD23-dependent stabilization of xeroderma pigmentosum group C protein." Genes Dev 17(13): 1630-1645.

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