Cell子刊：噬菌体对肠道菌群和代谢组的调控
噬菌体对小鼠模型肠道微生态和代谢组的动态调控
Dynamic Modulation of the Gut Microbiota and Metabolome by Bacteriophages in a Mouse Model
图形摘要
噬菌体在体内如何影响细菌群落还不清楚。Hsu等人通过携带已知菌群的小鼠研究了这个问题。噬菌体捕食直接影响对应的敏感（susceptible）细菌，导致对其他细菌物种的级联（cascading）效应，并对肠道代谢组产生影响。因此，噬菌体可以用来调节菌群和宿主。
翻译：秋芒树 帝国理工硕士毕业，目前失学失业，求收留ヾ(@^▽^@)ノ
责编：文涛 南京农业大学
原文链接：https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(19)30246-X
Cell Host and Microbe [IF:17.872]
DOI: https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.05.001
Resource 2019-06-04
第一作者：Bryan B. Hsu1,2
合作作者：Travis E. Gibson3, Vladimir Yeliseyev3, Qing Liu3, Lorena Lyon1,2, Lynn Bry3,
通讯作者：Pamela A. Silver1,2, Georg K. Gerber3,4
Email: pamela_silver@hms.harvard.edu (P.A.S.), ggerber@bwh.harvard.edu (G.K.G.)
1 哈佛医学院系统生物学系 (Department of Systems Biology, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA)
2 哈佛大学威斯生物启发工程研究所 (Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, Boston, MA 02115, USA)
3 美国 波士顿 马萨诸塞 宿主微生物互作中心 哈佛（附属）的布里格姆妇女医院 Massachusetts Host-Microbiome Center, Department of Pathology, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA
02115, USA
热心肠日报
链接：https://www.mr-gut.cn/papers/read/1042254347
Cell子刊：噬菌体对肠道菌群和代谢组的影响不容小觑
①给限菌小鼠定植组成明确的人肠道共生细菌群落，之后引入靶向其中特定细菌的裂解性噬菌体；
②噬菌体直接减少了其靶细菌的数量，并可与靶细菌长期共存，使对其有抗性的靶细菌富集；
③噬菌体对靶细菌的影响，通过细菌间互作，可波及到菌群中的其它非靶细菌成员，从而对菌群造成广泛影响；
④噬菌体对肠道菌群的影响可直接改变肠道代谢组谱，包括神经递质代谢物等可影响宿主生理的代谢产物。
主编推荐语：
噬菌体如何在体内影响菌群？《Cell Host and Microbe》发表的一项最新研究，使用限菌小鼠模型，揭示出噬菌体对其靶细菌的直接影响，可对菌群造成级联效应，波及其它菌群成员，导致肠道代谢组改变，从而可对宿主产生影响，这些发现对于研究靶向肠道菌群的噬菌体疗法，很有参考意义。
总结
人类肠道菌群由密集定殖的微生物组成，包括噬菌体，它们彼此之间，以及与哺乳动物宿主之间具有动态相互作用。为了解决噬菌体如何影响肠道细菌群落的问题，我们研究了噬菌体对模型菌群的动态影响。已知的人类肠道共生细菌在无菌小鼠中定殖，并受到有关联的（cognate）裂解噬菌体的捕食。我们发现噬菌体捕食不仅直接影响敏感（susceptible）细菌，还通过细菌间的相互作用对其他细菌物种产生级联（cascading）效应。此外，代谢组学分析还显示，噬菌体捕食引起的菌群变化对肠道代谢组产生了直接的影响。因此，我们的工作提供了噬菌体作为细菌定殖调节剂重要的生态学意义的见解，还表明了肠道噬菌体可以靶向调控细菌，这在哺乳动物治疗方面存在潜在应用的价值。
介绍
我们的身体包含的细菌细胞数目和我们自己的细胞数目一样多，结肠中的细菌细胞密度最大，为1014个。这种微生物组通过代谢交叉喂养和启动免疫系统等机制有益于人类健康。相反，不平衡或衰竭的（depleted）微生物组可能是有害的。与异常微生物组相关的疾病包括营养不良、胃肠疾病、肝脏疾病、心脏疾病和大脑疾病。随着我们对肠道微生物组在人类健康和疾病中的作用有了更多的了解，首要的问题就变成了: 肠道中的哪些因素影响我们的微生物，我们应该如何利用这些知识来调控微生物组？
目前调节肠道微生物组的途径包括饮食变化和抗生素，但这些方法会引起广泛和潜在的长期干扰。 对于肠道微生物组处于初期（nascent）状态的婴儿来说，干扰的后果尤其令人担忧，因为干扰会在短期内导致菌群多样性减少和不稳定增加，长期可导致过敏性疾病、肥胖症和哮喘发病率增加。对成年人来说，肠道微生物组被广泛破坏会导致短暂或更长时间的功能障碍状态，称为失调（dysbiosis），通常情况下，生态多样性会减少。因此，从基本的科学和治疗角度来看，需要在复杂的群落中更精确和合理地调节肠道菌群的策略。实现这一目标的有前途的方法是研究肠道细菌的生态拮抗剂（ecological antagonists）- 噬菌体。类似于为治疗目的研究天然产物或其衍生物，研究噬菌体在肠道中的作用可以为下面这些问题阐明新的路径：
(1)有目的性和合理地调控特定细菌；
(2)阐明细菌间和细菌-哺乳动物宿主相互作用介导的因果关系，以及
(3)最终设计精确和可预测的方法来重塑肠道微生物群落以达到治疗目的。
噬菌体是原核病毒，是肠道中最丰富的微生物之一，但也是最不为人知的微生物之一。这些病毒通常通过对细菌裂解性侵染或溶源性侵染来繁殖，通常具有物种水平的特异性。虽然它们的宏基因组组成与炎症性肠病和营养不良等疾病有关，但对噬菌体在肠道中的实际作为仍知之甚少。类似于理解宏观环境中顶级捕食者的重要性，阐明噬菌体的捕食行为有可能在胃肠生态系统中提供类似的见解。然而，追踪噬菌体捕食对哺乳动物宿主和微生物代谢的因果关系极具挑战性。被已知的、物种数量有限的，但仍然复杂的细菌群落所定殖的无菌小鼠，为全面表征噬菌体在肠道环境中的行为提供了一个有吸引力的模型系统。
例如，Reyes等人将从粪便中纯化出来的未经描述的（uncharacterized）类病毒颗粒（viral like particles）混合物施加于已经定殖有15种细菌无菌小鼠中，并从噬菌体基因组的增加和细菌基因组的减少中得出结论，即可能是逐步（stepwise）的噬菌体-细菌感染机制在起作用。尽管作者推断了两种噬菌体的噬菌体-细菌相互作用，但他们无法类似地识别在施加噬菌体后，其他三种噬菌体在肠道中持续存在的易感细菌。他们的研究的缺陷在于，无法在体外验证这些相互作用，并且他们研究中使用的是未经描述的噬菌体，这就会带来含混不清的影响。这些缺陷都突出表明了需要利用一组确定的、经过描述的噬菌体和一组确定的细菌群落。
在这项工作中，我们将裂解性噬菌体施加在已经被一组确定的人类共生细菌中定殖的无菌小鼠中，并使用高通量测序和定量PCR纵向地跟踪每种微生物的反应。我们发现噬菌体导致肠道中敏感（susceptible）物种被靶向地敲低（knockdown），并通过细菌间的相互作用进一步调节其他的细菌，导致这些物种的大量繁殖或者灭亡（blooms and attrition）。通过比较一个完整细菌群落的定殖模式和那些被噬菌体靶向排除了的细菌物种的定殖模式，我们发现了噬菌体同时捕食的因果效应。
利用广泛的代谢谱，我们证明噬菌体捕食不仅引起细菌的组成变化，并调节肠道代谢组。这些发现暗示了噬菌体捕食对哺乳动物宿主的影响，以及噬菌体在治疗中的潜在用途。
结果Result
1 噬菌体对人类肠道代表性共生细菌具有个体特异性
Phages Are Specific for Individual Species among Representative Human Gut Commensals
我们构建了一个由兼性厌氧和专性厌氧共生细菌组成的微生物群落模型，可以稳定地在无菌小鼠中定殖。
这十个选定的物种代表了人类肠道微生物组中的主要门，即厚壁菌门(Firmicutes) 中的 Clostridium sporogenes 和 Enterococcus faecalis、拟杆菌门(Bacteroidetes)中的Bacteroides fragilis, Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus 和 Parabacteroides distasonis、变形菌门(Proteobacteria)中的Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Escherichia coli和Nissle 1917和疣状球菌门(Verrucomicrobia)中的Akkermansia muciniphila。所选的每一个物种都很容易从菌株集合中获得，也可在体外培养，并具有遗传特征。我们选择了其中四个物种的转移裂解性噬菌体，因为它们在微生物库中可获得，也可以在过去的文献中检索到相关的描述，分别是E. coli 的T4噬菌体、C. sporogenes 的F1噬菌体、B. fragilis 的B40-8噬菌体和E. faecalis 的VD13噬菌体。
我们首先通过测试噬菌体对一组人类肠道共生细菌的裂解能力来验证噬菌体的特异性。我们使用斑点试验（spot assay），测试了每种细菌对5毫升的每种裂性噬菌体的敏感性(~109 pfu/毫升)。根据细菌的培养条件，在37℃好氧或厌氧培养后，我们发现
T4噬菌体、F1噬菌体、B40-8噬菌体和VD13噬菌体只裂解它们的敏感细菌，对其他共生细菌没有明显影响。
图1 哺乳动物肠道噬菌体行为的动态特征
(A)用含有2 10 6 至
2 10 7 cfu的细菌混合物对单独饲养的无菌C57Bl/6小鼠(n = 5)进行口服管饲（gavage）。在第16.1天和第30.1天，用碳酸氢钠灌胃以中和胃酸，随后每种噬菌体饲喂 2 * 10 6 pfu。在整个实验过程中定期收集粪便样本，使用分子方法对其中的细菌和噬菌体进行定量。(B)每种噬菌体和靶向的细菌的浓度分别显示为(每克粪便中估计的pfu)和(每克粪便中估计的cfu)。y轴的浓度以log10转化后显示。
(C)小鼠选定样品中E. faecalis 的数量(n = 5)和体外测定的抵抗VD13噬菌体裂解的菌落百分比。
2 噬菌体在哺乳动物肠道中减少靶向细菌的数量并与其共存，产生了易感细菌和抗性细菌的混合种群
Phages Knockdown and Coexist with Targeted Bacteria in the Mammalian Gut and Lead to Mixed Populations of Susceptible and Resistant Bacteria
我们试图在复杂但已知的肠道细菌群落中描述噬菌体及其靶向细菌的行为。
如图1A所示，我们用我们定义的细菌群落接种无菌小鼠(A. muciniphila 和P. mirabilis, 每种2 10 6 cfu，其他每种2 107 cfu)，然后引入噬菌体(每种噬菌体2 106 pfu)，用来靶向细菌种群的子集。使用T4噬菌体和F1噬菌体分别靶向E. coli 和C. sporogenes ，接着使用B40-8噬菌体和VD13噬菌体分别靶向B. fragilis 和E. faecalis*。噬菌体成对施用，以探测多重同时扰动（multiple simultaneous perturbations）是否可能具有协同或抵消效应。每组噬菌体都包含针对兼性厌氧菌和专性厌氧菌的噬菌体，以减少潜在的一组噬菌体对另一组噬菌体的偏差。收集了一系列粪便样本，在施加噬菌体前后收集的频率更高，期望获得丰富的动态变化信息。
我们结合了定量PCR和高通量测序（next-generation sequencing techniques ）对检测噬菌体和细菌，从推算出噬菌体和细菌浓度。与所有高通量分子生物学方法一样，可能引入了以前已经记录过的与样品储存和DNA提取等因素相关的偏差。除此之外，我们还发现在细菌总浓度的推算中引入了偏差。为了减少这些偏差对我们结果的影响，我们利用我们研究的时间序列设计，主要分析个体物种随时间的变化(例如，施加噬菌体前后)。
我们的分析表明噬菌体和它们的靶向共生细菌都存在于肠道中。施加噬菌体4-6小时后，每种噬菌体都可以被检测到，之后在整个实验期间都可以被检测到(图1B)。先前的研究发现，持续缺乏易感细菌，无菌小鼠中的T4噬菌体，无法复制，在两天内脱落。鉴于这些结果，我们感兴趣的是确定在我们的系统中持续存在的细菌是否获得了对噬菌体的抗性。因为我们的细菌群落包含系统发育多样性的菌株和密切关联的菌株，如在天然肠道微生物群落中发生的，为了噬菌体抗性测定的需要从粪便中分离单个细菌物种是一项挑战。然而，使用选择性培养基，我们能够从粪便中分离E. faecalis，并测试其对VD13噬菌体的敏感性。
如图1C所示，在噬菌体施用前(第27.1天)和之后不久(第30.5天)，E. faecalis的分离株完全对噬菌体是易感的(敏感性极限，1.6%)。然而，在第2天(第32.3天)和第10天(第40.2天)后，分别发现28%和68%的被测菌落具有噬菌体抗性。当结合E. faecalis 浓度的变化考虑时，这些结果表明噬菌体定向敲低（knockdown）细菌(~ 2个数量级)导致噬菌体抗性亚群的富集。
3 噬菌体对非靶向的微生物群落的物种诱导产生级联效应
Phages Induce Cascading Effects in Species in the Microbiota Not Directly Targeted
对每种细菌物种的纵向跟踪表明，噬菌体捕食诱导微生物数量变化，包括对噬菌体不敏感的细菌物种。当根据估计的每个物种的浓度检查细菌组成时(图2A)，我们发现施加噬菌体会诱导群落中低丰度（abundance）和高丰度的物种发生转变。例如，在第16.1天施加第一组靶向E. coli 和C. sporogenes 的噬菌体后，低丰度物种B. vulgatus、P. mirabilis 和P. distasonis(~10 6，估计的每g粪便中细菌数)和高丰度物种A. muciniphila 和 B. fragilis （(~10 8 估计的每g粪便中细菌数)都发现了可以观察到的转变。但第30.1天施加第二组噬菌体的作用不太明显，即使分别检查每个物种，变化依然不明显。第一组噬菌体与第二组噬菌体观察到的这些非常不同的效应突出了噬菌体效应的特异性，并且反对了噬菌体施加本身的任何系统性效应的说法(例如，口服灌胃或载体效应产生的压力)，这些发现都与之前的研究一致。
图2 噬菌体对共生肠道菌群的影响
Effect of Phage on the Commensal Gut Microbiota
(A)估算的粪便中的细菌丰度，下图是顶图的放大版本，用来展示低丰度的信息。来自单独饲养小鼠(n = 5)的每种细菌物种估算的细菌浓度的几何平均值显示在堆叠条形图中。y轴为线性刻度。
(B, C)每种细菌物种的丰度取对数变换(log10)，数据来源于图2A，由第一组噬菌体(B)和第二组噬菌体(C)的施加而产生的变化。x轴代表噬菌体施加后经过的时间，当噬菌体施加时，垂直虚线划分 t = 0。
如图2B所示，为了量化噬菌体施加引起的细菌定殖的变化幅度，我们计算了每种噬菌体施加后与前一天相比，浓度的变化。我们发现，在第一组噬菌体施加期间，C. sporogenes 和E. coli 的敲低（knockdown）导致B. vulgatus，P. mirabilis 和A. muciniphila 快速且大量的繁殖，随后是P. distasonis 和B. ovatus 的逐渐扩张，以及B. fragilis 的逐渐减少。第二组噬菌体对周围微生物组的影响不太明显，E. coli 和C. sporogenes的扩张幅度最小，其他物种的波动接近基线。
尽管背景菌群有所变化，噬菌体捕食并没有消灭最初存在的物种。如图2A所示，在施加噬菌体后，没有细菌种类被完全消除。事实上，总细菌量没有明显变化。有人认为捕食者的存在会给生态系统带来更大的稳定性。在我们定义的微生物群落中的Bray-Curtis相异度（dissimilarity）显示，随着噬菌体的每次连续施加，小鼠之间和相邻时间点之间的相异度（dissimilarity）逐渐减小。这一现象间接表明，微生物群落在形成是一个更稳定的系统，表明噬菌体捕食可能有利于增加细菌群落的稳定性。
4 噬菌体靶向细菌缺失实验描述了细菌相互作用的因果效应
Dropout Experiments of Bacteria Targeted by Phages Delineate Causal Effects of Bacterial Interactions
通过比较有靶向噬菌体施加和没有靶向噬菌体施加的细菌定殖情况，我们揭示了噬菌体对周围微生态（surrounding microbiota）可量化的影响。如图3A中概念性地提出的，比较物种1存在时的细菌集合(完整联盟，full consortium)和物种1不存在时的细菌集合(细菌缺失，Bacterial dropout)，可以洞察其对周围微生态的促进和抑制作用；噬菌体捕食导致更大程度的细菌敲低（knockdown），其效果接近细菌缺失（dropout）。为此，选用九中细菌定殖无菌小鼠，并且依次缺失每种噬菌体的靶向细菌(图3B)。如图3C所示，尽管在定殖过程中总体平均细菌密度相似，但每一组小鼠都显示出显著的组成差异: 整体群落 = 1.13
10 9 估计的每g粪便中细菌数，E. coli 缺失= 7.0
10 8，C. sporogenes 缺失 = 1.3
10 9，B. fragilis 缺失 = 1.1
10 9，E. faecalis 缺失 = 8.9
10 8。在第16.1天，我们通过比较在缺失实验中每个剩余物种的密度，和其在完整集合中的密度来计算每个缺失物种的影响。如图3D所示，*每个缺失的物种对已知的集合具有不同的影响模式，这表明噬菌体对每个细菌物种的敲低都可以产生表型独特的结果。
图3 细菌缺失对模拟群落定殖的影响
Impact of Bacterial Dropouts on Colonization of Consortia
(A)概念解释：周围微生物群落的集群密度如何对细菌缺失群落中单个物种(物种1)的缺失做出反应的示意图。实线以箭头终止，表示假设的促进，虚线以正交线终止，表示假设的抑制。“完整集合（Full consortium）”，即左图，示意性地描述了细菌物种1、2和3的浓度。而“细菌敲低（Bacterial knockdown，中图）”和“细菌缺失（‘Bacterial dropout，右图）”设置描述了物种1减少和消除时，对物种2和物种3的影响。
(B)实验室示意图：为了确定细菌群落中细菌缺失的影响，使用含有九种细菌成员的细菌混合物，对四组五只单独饲养的无菌C57Bl/6小鼠灌胃，依次缺失E. coli, C. sporogenes, B. fragilis 和E. faecalis。
(C)完整（第1列）模拟群落或某种细菌缺失（第2-4列）群落的估计的总定殖密度显示在一个堆叠柱状图中，该图具有一个完整的上面板和一个放大的下面板，下面板显示低丰度物种。y轴以线性比例显示，每种细菌的浓度是从每组小鼠(n = 5)计算的几何平均值。
(D)在第16.1天，细菌缺失群落中每个细菌物种对数(log10)变换定殖差异倍数。每个条代表平均值 ± 标准差。
在某些情况下，噬菌体定向敲低（knockdown）可以具有接近细菌缺失的消减效果， 例如T4噬菌体，其在给药后立即显著减少E. coli 的数量。正如我们假设的相互作用网络所示(图4A)，E. coli 很可能通过细菌相互作用强烈促进B. fragilis 并强烈抑制B. vulgatus ，因此其被第一组噬菌体敲低（knockdown）可能导致B. fragilis 的减少和B. vulgatus 的扩张。这些影响的程度接近缺失研究中观察到的水平(图4C)，这可能是因为E. coli 是这些细菌物种的主要影响者。
图4 .肠道菌群中的细菌相互作用网络
Bacterial Interaction Network in the Gut Microbiota
将定殖期限（16.1天）延长之后，比较完整的十个细菌成员集合的定殖实验和被噬菌体靶向的细菌的缺失定殖实验的不同，而假设的因果相互作用网络。数据信息来源于图3D, 这里只是将数据可视化。
(A, B) 代表E. coli 与C. sporogenes (A) 和E. faecalis 与 B. fragilis (B)相互作用的网络。线宽对应于细菌缺失引起的定殖密度变化，即log10转化，实线以箭头终止，表示假设的促进，虚线以正交线终止，表示假设的抑制。
(C，D) 在施加第一组噬菌体(T4和F1），靶向E. coli 和C. sporogenes (C)和施加第二组噬菌体(B40-8和VD13），分别靶向B. fragilis 和E. faecalis (D)后的选定时间点(0.3天、2天和13天)，来自与完整集合定殖的小鼠的每种物种的浓度的log10变换值。条形代表平均值 ± 标准差。
当两个相反的效应作用于同一个物种时，因果效应就会变得模糊，不过仍然可以用相互作用网络来合理解释。 例如，在施用第二组针对E. faecalis 和B. fragilis 的噬菌体后，我们发现对周围微生物群落的定殖影响相对较小(图2C)。然而，我们针对第二组被噬菌体靶向的细菌物种的相互作用网络(图4B)表明A. muciniphila, B. ovatus, B. vulgatus, P. distasonis 和P. mirabilis 被B. fragilis 抑制，并且被E. faecalis 促进。因此， 施加第二组噬菌体会同时敲除这两种被噬菌体靶向的细菌物种，这可能会将抑制或者促进的效应抵消，导致它们对群落的个体效应无效，导致对整个细菌集合定殖的影响忽略不计。
我们还观察到由于噬菌体捕食产生的细菌时间动态的效应，这可以用细菌相互作用来解释。 例如，我们观察到，尽管其他物种立即表现出反应，但P. distasonis 在噬菌体施加约3天后才开始了扩张(图2B)。如图4A所示，细菌相互作用暗示了这种行为的机制。在引入第一组噬菌体后不久，C. sporogenes 和E. coli 分别被噬菌体F1和T4敲低（knockdown）(图1B)，这导致它们各自失去了对P. distasonis 促进和抑制的效应。随着E. coli 的持续敲低，由于去抑制作用，P. distasonis 也经历了持久的扩张。然而，C. sporogenes 只经历了最初的短暂敲低，其在最初几天之后的恢复与P. distasonis 的促进相一致，因此，解释了P. distasonis 在第3天之后开始的第二次扩张。P. mirabilis 也观察到了类似的效果，不过程度较低，这是因为C. sporogenes 的促进作用较弱。
我们的结果还表明了一些更深层次的级联效应（cascading effects），不过在我们的交互网络中没有捕捉到。这些效应来自于缺失实验。如图4C所示，通过第一组噬菌体敲低（knockdown）E. coli 和C. sporogenes，导致A. muciniphila 的富集大大超过缺失实验所描述的。当我们的研究检查了细菌集合十个成员中的四个成员的因果效应时，A. muciniphila 很可能经历了来自微生物群落其他成员(例如，B. vulgatus, B. ovatus, P. distasonis和/或 P. mirabilis )的附加影响。
5 噬菌体调节细菌影响了肠道代谢组
Bacterial Modulation Induced by Phages Impacts the Gut Metabolome
我们试图通过肠道代谢组的变化来描述噬菌体捕食对微生物组的功能效应。 总的来说，我们的预期是，大多数代谢物的水平会降低，以应对由于我们定义的细菌集合中代谢冗余而引起的干扰，但是与我们集合中特定物种特有的微生物途径相关的化合物将对细菌组成的扰动敏感。使用非靶向代谢组学，我们研究了小鼠定殖不同阶段的粪便代谢物，即无菌、稳定的细菌定殖后、引入E. coli 和C. sporogenes 的噬菌体后，以及引入E. faecalis 和B. fragilis 的噬菌体后（图5A）。
总的来说，噬菌体引导的肠道微生物组的重建对代谢物的数量影响相对较小。 第一组噬菌体的施加导致17%的受检化合物发生统计学上显著的变化，但有趣的是这些代谢物代表了几乎所有的KEGG途径(例如，氨基酸、肽、碳水化合物、脂质、核苷酸、辅因子（cofactors）、维生素和异生物质（xenobiotics）)(图5B)。我们还发现，第二组噬菌体的在代谢产物数量方面的影响相对有限，因为只有0.7%的代谢物受到显著影响(图5C)，这与微生物群落相对有限的变化相一致，微生物群落的变化主要是施加噬菌体13天后E. faecalis 的减少(图5E)。相比之下，将细菌引入无菌小鼠后，粪便代谢组发生了广泛的变化，所有KEGG途径中总共860种代谢物中的60% (514种代谢物）增加了，15% (127种代谢物)减少了。综上所述，这些观察结果表明代谢组学受影响的广度反映了肠道微生物组中组分变化的程度。
6 噬菌体可以调节与特定细菌独特相关的神经递质代谢物
Phages Can Modulate Neurotransmitter Metabolites Uniquely Associated with Specific Bacteria
我们观察到，在某些情况下，噬菌体捕食的特异性允许靶向特定的细菌物种，并因此敲低（knockdown）特异相关的代谢产物。 色胺（Tryptamine）是一种通常来源于植物的神经递质，但也可以由少量的共生肠道细菌通过色氨酸脱羧（tryptophan decarboxylation）产生。而这个基因在大约10%的人类肠道细菌宏基因组中存在，到目前为止仅在两个具有遗传特征的物种中被鉴定，即R. gnavus 和C. sporogenes，后者是我们定殖的细菌集合中的成员。与我们集合的其他成员相比，R. gnavus (rumgna_01526)和C. sporogenes (clospo_02083)色氨酸脱羧酶氨基酸(tryptophan decarboxylase amino acid)序列的BLAST检索结果显示蛋白同源性差，这与C. sporogenes 的独特关联相一致。在第一组噬菌体施加期间，我们检测到色胺分别在0.3、2和13天降低了10、17和2倍，如图5F所示的氨基酸途径所示。这分别对应于C. sporogenes 降低840倍、4倍和4倍(图5D)。
作为另一个例子，神经递质酪胺（tyramine）是由产乳酸的细菌（lactic acid bacteria），包括E. faecalis，通过酪氨酸脱羧（tyrosine decarboxylation）产生的。E. faecalis 是我们细菌集合中唯一的产乳酸的细菌。我们在文献中没有发现酪氨酸脱羧酶（yrosine decarboxylase）与其他联盟成员的关联，也没有发现与E. faecalis 的tyrDC蛋白有任何显著的蛋白同源性。这与酪氨酸脱羧（tyrosine decarboxylation）功能只与E. faecalis 有关相一致。施加第二组噬菌体导致酪胺（tyramine）减少4、2.7和4倍(分别在0.3、2和13天)，如图5G的氨基酸途径所示。这相对应于E. faecalis 分别减少了1.3倍、9倍和42倍(图5E)。由于经过实验验证的微生物代谢物数量有限，很难广泛地将特定代谢物与我们细菌集合中的单个物种联系起来。然而，色胺（tryptamine）和酪胺（tyramine）分别与C. sporogenes和E. faecalis的独特关联表明噬菌体、细菌和代谢物之间存在明显的因果联系。
7 噬菌体可以通过多种细菌物种，调节对寄主有影响的代谢物
Phages Can Modulate Metabolites with Known Mammalian Host Effects Associated with Multiple Bacterial Species
与微生物代谢相关的化合物更广泛地受到噬菌体转变的影响。 例如，第一组噬菌体两种氨基酸，丝氨酸和苏氨酸，在粪便中的浓度增加了，这两种氨基酸在O-glycosylated intestinal mucin中具有很高的代表性，这与我们观察到的A. muciniphila 和B. vulgatus由于噬菌体效应而富集的现象相一致。
我们还发现由于第一组噬菌体，胆盐（bile salts）也发生了显著变化。哺乳动物宿主产生的牛磺和糖共轭的一级胆汁盐（Tauro- and glyco-conjugated primary bile salts）经历微生物转化，包括胆汁盐水解酶(bile salt hydrolases，BSH)的氨基酸解共轭（deconjugation）和羟基类固醇脱氢酶(hydroxysteroid dehydrogenases，HSDH)的脱氢。
我们发现第一对噬菌体对细菌群落的调节增加了去偶联胆汁盐(deconjugated bile salt)，
胆酸盐硫酸盐(cholate sulfate)，并减少共轭胆汁盐(conjugated bile salt)，牛磺鹅去氧胆酸7-硫酸盐(taurochenodeoxycholic acid 7-sulfate)(图5F)。我们发现第一对噬菌体对细菌群落的调节增加了去共轭胆汁盐胆酸盐硫酸盐(cholate sulfate)，并减少了共轭胆汁盐牛磺鹅去氧胆酸7-硫酸盐(图5F)。
这表明胆汁盐水解酶（BSH）的活动增加了，我们发现这主要与我们的细菌集合(B. fragilis, B. ovatus, B. vulgatus, C. sporogenes, E. faecalis, E. coli, P. distasonis 和P. mirabilis)有关，如MetaCyc数据库中所述。我们还检测到两种去偶联的次级胆盐（deconjugated, secondary bile salts）的增加，这两种胆盐在无菌小鼠中没有检测到，因此是微生物来源的12-去氢胆酸盐（12-dehydrocholate）和ursocholate。前者由12a-HSDH的活动产生，而后者由7a-HDSH和7b-HDSH连续活动产生。与直觉相反，每种酶都与B. fragilis, C. sporogenes 和E. coli 相关，这三种细菌在第一组噬菌体施加后相应减少。还可能涉及其他因素，包括主要宿主对胆盐吸收的变化，以及其他成员对胆盐代谢的能力，这些都有待于实验的证实。
图5 粪便代谢组学分析
Analysis of the Fecal Metabolome
(A)从被已知的细菌群落定殖的无菌(GF)小鼠中收集粪便样品，然后施加第一组噬菌体(T4和F1)和第二组噬菌体(VD13和B40-8)(n = 5)。为了确定粪便代谢物浓度的相对变化，将测得的代谢物量标准化为噬菌体施加之前的量。圆圈表示对粪便采样，箭头表示比较。
(B, C)火山图显示，在施加第一组噬菌体(B)后13天和在施用第二组噬菌体(C)后13天，每种代谢物增加的显著性(y轴)对倍数变化(x轴)，水平虚线上方的点表示错误发现率调整后的 p < 0.05的显著变化。
(D, E)为了帮助直接比较每种代谢物相对于细菌群落的变化，细菌浓度（每克粪便中的细菌数目）平均倍数变化的分层聚类。在引入第一组噬菌体(D)和第二组噬菌体(E)后，用Log2比例的热图显示。
(F, G)在施加第一组噬菌体(F)和第二组噬菌体(G)后，用Log2比例的热图对显著变化(错误发生率（FDR）调节后的p < 0.05)的代谢物进行分层聚类。无菌（GF）小鼠中每种代谢物存在的截止时间是在5只小鼠中的至少4只中检测到的时间。文中讨论过的代谢物以粗体显示。
讨论
我们的结果表明，裂解性噬菌体不仅敲低（knockdown）了它们的靶向细菌，还通过级联效应影响定殖在肠道的共生细菌群落中非靶向的细菌物种。我们的研究揭示了一个高度互动和动态的群落，其中裂解性噬菌体共存并敲低靶向细菌，其效果通过微生物组的其他成员传播，最终调节肠道代谢组。
我们的工作建立在先前研究的基础上，最大限度利用我们实验设置的优势并提供了见解。虽然已经提出噬菌体在系统发育组成方面作用不大，但是先前所采用的NGS方法通常只获得属水平的分辨率，这可能掩盖了物种水平的变化。我们使用确定细菌集合的结果表明，噬菌体捕食对非靶向细菌物种的影响可能没有得到充分认识。另一项研究同样使用无菌小鼠，他们的结果表明，噬菌体捕食会导致小鼠肠道微生物群落的组成发生变化，但是它们使用的是没有描述过的噬菌体混合物，不能在体外验证噬菌体在细菌群落中的感染性。并且他们使用相对丰度纵向跟踪肠道细菌，没有使用绝对浓度，这就很难研究清楚捕食过程中的直接影响和间接影响。通过噬菌体-细菌相互作用的体外验证，我们可以将噬菌体靶向敲低（knockdown）的效果与随后通过细菌间相互作用对微生物群调节的效果分开。如图2中所示，很明显，对细菌物种的靶向调节对肠道中定殖的其他物种具有后续效应。
虽然噬菌体捕食通常是在物种级别或菌株级别对细菌的特定影响来观察的，但我们的结果强调了细菌群落内细菌间相互作用和潜在级联效应的重要性。 我们的发现与胃肠环境(如密集定居、生态位竞争和营养限制)如何促进物种间激烈竞争和合作的新认识一致。尽管细菌间的相互作用显然很重要，但鉴于目前可用的工具有限，在体内进行实验鉴定和确实是一项挑战。类似地，在分子生物学中，确认基因功能的一般策略是使用基因敲除来验证功能丧失，然后通过将基因重新引入敲除体来验证功能的重新获得。我们的结果表明噬菌体可以为微生物组提供类似的信息，尽管是以分级（graded），而不是以绝对的方式。
多种噬菌体的合理部署可以选择性地调节某些物种，同时最小化对周围微生物群的级联影响。 例如，E. faecalis 和B. fragilis 的模拟敲除导致微生物群落中最小的级联效应，尽管在定殖密度上，E. faecalis (~10 5， 每克粪便中的细菌数)和B. fragilis (~10 7，每克粪便中的细菌数）在定殖密度上存在巨大的差异。一种可能性是先施用E. coli 和C. sporogenes 的噬菌体会抑制微生物组对随后施加的B. fragilis 和E. faecalis 噬菌体的反应。然而，我们倾向于另一种情况，B. fragilis 和E. faecalis 敲低的级联效应部分地相互抵消，这可以通过我们从菌群缺失实验中得到的细菌间相互作用网络来解释。来自低丰度物种的强烈影响并不是前所未有的，以前在共生细菌相互作用中也观察到过，例如低丰度的Clostridium scindens 抑制Clostridioidies difficil 感染，我们的结果强调了这种影响也可能发生在共生细菌相互作用中。 我们对各种相互作用的识别引出了一个有趣的后续问题，即这些细菌如何调节它们对哺乳动物肠道生态系统的影响。除了直接的相互作用，如交叉喂养、抗菌肽、群体感应（quorum sensing）和营养竞争，细菌还可以招募宿主来改变局部环境，比如通过炎症的方式。总的来说，我们的发现表明，具有适当特性的噬菌体可以作为研究微生物群落的动力学和相互作用结构的有力工具，提供持续的敲低或精确的瞬时扰动。
我们的结果还揭示了噬菌体在肠道微生物组中的捕食作用对哺乳动物宿主有潜在的影响， 这可以通过肠道代谢组的调节来证明。微生物代谢物在调节细菌和哺乳动物宿主之间的相互作用中具有重要作用，噬菌体和微生物代谢物之间的联系提供了一种有趣的治疗途径。其他细菌调节方法，如抗生素，可能对微生物代谢产生长远和不可预测的影响，链霉素（streptomycin）和头孢哌酮（cefoperazone）证明了这一点，它们分别影响了能够检测到的小鼠粪便代谢物中的87%和53%。相比之下，噬菌体可以引发物种靶向效应，比如：以通过噬菌体对减少色胺（tryptamine）的C. sporogenes 的捕食可以加速胃的流动性。对减少酪胺（tyramine）的E. faecalis 的捕食可以诱导回肠收缩。尽管仍然需要做大量的工作来表征肠道微生物代谢，但是噬菌体对细菌靶向敲低可以调节微生物代谢，这是一种可以用于治疗目的的潜在途径。
噬菌体和敏感细菌的纵向特征使我们能够观察噬菌体在肠道微生物群中的捕食动态。我们的发现之一是裂解性噬菌体在肠道中持续存在，被靶向的细菌经历了敲低（knockdown）而不是根除，这与我们发现的T4噬菌体与E. coli 共存一致。过去的研究表明，T4噬菌体可以在哺乳动物肠道中的易感细菌上繁殖，更一般地说，裂解性噬菌体和细菌可以共存数周。有趣的是，T4噬菌体和一种类T4（T4-like）噬菌体ED6在用E. coli 单一定殖的小鼠中仅持续一天至两天，而另一种裂解性E. coli噬菌体T7却持续数周。综上所述，这些结果表明背景菌群可能是维持噬菌体在肠道中繁殖的重要因素，这可能是通过细菌间的相互作用发挥作用的。
已经提出噬菌体不能完全根除靶向细菌是由于遗传或生态抗性机制。 在我们的研究中，我们发现以E. faecalis 为靶标的裂解性噬菌体的引入导致在最初的噬菌体易感群体中出现大量噬菌体抗性突变体。先前的工作已经表明Vibrio cholerae 对裂解性噬菌体的遗传抗性的发展与适应性受损相一致，允许易感菌株持续存在并因此繁殖噬菌体。在体外和其他生态系统中也观察到了类似的抗性适应成本，这可能解释了为什么在人类肠道病毒中几乎没有观察到细菌抗性和噬菌体捕食之间共同进化的证据。其他机制，如细菌物理上无法接触噬菌体的生态抗性，也可以解释为什么噬菌体靶向细菌会在肠道中持续存在。此外，体外研究表明，噬菌体在粘膜表面的扩散减少，这表明与管腔相比，噬菌体在肠粘膜中的感染动力学可能发生改变，这可能解释了噬菌体对B. fragilis (一种对肠粘膜具有更大嗜性的物种)的捕食作用与通常在管腔中发现更多的E. coli 的捕食作用的差异。
微生物的复杂性和多样性以及它们在肠道中的相互作用带来了巨大的实验挑战。一般来说，每个个体的人类肠道微生物组都是独特的，通常有不可培养且难以在系统发育上进行分类的微生物组成，经常受到生活方式、药物、饮食和环境因素的干扰，并受到哺乳动物宿主的相互影响。因此，为了研究与人类肠道微生物组相关的复杂生物过程的机制，必须在模型对人类肠道的再现程度和实验实用主义之间达成妥协。我们使用的遗传近交的非繁殖小鼠模型中有10种可培养的已描述的人类共生细菌菌株，包括了适度的复杂性和细菌多样性，同时将潜在的混淆变量（confounding variables）降至最低。我们发现裂解性噬菌体可以在肠道微生物群中发挥广泛的意想不到的实质性的作用，但是这仅仅是它们潜在功能影响的一个微弱表现，因为它们具有不同的生活方式(例如，溶源的生活方式)、对于细菌物种的不同的侵染性范围以及水平基因转移的潜力。此外，尽管噬菌体在细菌物种之间通常具有狭窄的侵染性范围，但是它们可以在相同物种的菌株之间表现出广泛的侵染性。因此，该领域的一个重要目标将是开发在完全完整的微生物群落中表征噬菌体效应的方法，例如在常规小鼠或人类群体中。 通过阐明噬菌体和共生细菌在一个简化但仍然真实的肠道环境中的动态关系的细节，我们的工作提供了一个框架来指导这些未来在更复杂环境中的研究，这些研究将寻求阐明噬菌体、微生物群和宿主健康和疾病之间的相互作用。
小编有话说
据小编有限的浅薄的知识来看，这是第一篇描述噬菌体在肠道中功能的文章，以前有研究在肠道中噬菌体与细菌相互作用的动态变化的文章。所以这篇文章还是具有十分重要的意义。不过他们使用的是，用经过描述过的已知细菌构建的一个人工的细菌集合。如果在一些自然状态下具有简单细菌组成的模式动物中，进行类似的实验，那我们对噬菌体在肠道中的作用会有更加清晰的认识。
这篇文章的实验思路可能有些复杂，小编在此简单整理一下，如有错误，欢迎批评指正。这篇文章一共进行了两组实验，实验设计参照图1A, 图3B和图5A。其中图1A和图5A描述的是施加噬菌体实验，在两个时间点施加不同的两组噬菌体。图3B描述的是，十缺一的细菌缺失实验。那这两组实验的关系是什么呢？
我的理解是，在第一组施加噬菌体的实验中，一共施加了两对不同的噬菌体，随后对细菌集合中的成员产生了非常不同的效应。其中的原因是什么呢？作者试图用第二组十缺一的细菌缺失实验来解释两对不同的噬菌体产生的不同的效应。作者认为噬菌体对细菌的定向敲低（knockdown）可以具有接近细菌缺失的消减效果。 第二组实验使用十缺一的细菌定殖无菌小鼠，观察数量的变化，得到在一种细菌缺失的情况，其中细菌的数量变化，进而得出了细菌之间相互作用的网络图，如图4A和图4B所示。发现这个网络关系用来解释第一组的结果是说得通的。
Reference
Hsu, BB, Gibson, TE, Yeliseyev, V, Liu, Q, Lyon, L, Bry, L, Silver, PA, and Gerber, GK. (2019). Dynamic Modulation of the Gut Microbiota and Metabolome by Bacteriophages in a Mouse Model. Cell Host & Microbe 25, 803-814.e805.
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S193131281930246X?via%3Dihub
延伸阅读
Reyes, A., Wu, M., McNulty, N.P., Rohwer, F.L., and Gordon, J.I. (2013). Gnotobiotic mouse model of phage–bacterial host dynamics in the human gut. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 20236–20241.
https://www.pnas.org/content/110/50/20236
译者简介
秋芒树，本科毕业于中国农业大学，硕士毕业于英国帝国理工学院Computational Methods in Ecology and Evolution专业。关注婴儿肠道微生物，肠道细菌与噬菌体的相互作用。在宏基因组公众号发表《Nature：TEDDY计划中幼儿肠道微生物组随时间的发育》、《Cell子刊：成年同卵双胞胎的病毒组多样性与肠道微生物组多样性相关》、《CHM：新生儿肠道微生物菌群研究》等。欢迎批评、指正和交流，微信：w18813001339。
责编：文涛 南京农业大学
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