Nature | 沙门氏菌耐药性传播机制

原创敏君 BioArt

撰文 | 敏君

责编 | 兮

细菌通过基因突变或者获取耐药质粒等新遗传材料的方式产生抗生素耐受性（图1），耐药细菌的产生严重威胁了全球公共健康【1】。持留菌（persisters）是细菌的一类亚群，能够可逆性调节自身生理机能从而对抗生素产生耐受性【2】。鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）能够形成持留菌，并在受到抗生素胁迫时在多种宿主组织中存活。沙门氏菌和大肠杆菌（E. coli）中包含多种耐药质粒，这些不同的菌株经常定植于同一宿主中，而肠道内较高的细胞密度使质粒得以在菌种内以及种间传播【3】。在没有相应耐药基因的情况下，抗生素能够在数小时内消灭肠道内的沙门氏菌菌群，而组织相关的沙门氏菌持留菌细胞则能够存活超过十天，当停用抗生素后，存活的细胞能够迁移至肠道腔内并恢复生长。而持留菌能否促进耐药质粒的传播，目前仍不清楚。

图1 细菌通过基因突变或基因水平转移的方式获得耐药性

2019年9月5日，瑞士苏黎世联邦理工学院（ETH）Wolf-Dietrich Hardt教授和Médéric Diard教授在Nature杂志联合发表了题为Salmonella persisters promote the spread of antibiotic resistance plasmids in the gut的文章，该研究揭示了组织相关的沙门氏菌持留菌能够作为耐药质粒的储存库，促进细菌耐药性在肠道内传播。

该研究中，作者猜测抗生素处理会促进肠腔内受体菌（recipient）和供体菌（donor）的共存，从而驱动抗性质粒的转移。为证明这一猜想，作者以携带接合质粒（conjugative plasmid）P2的野生型沙门氏菌SL1344作为供体，并用氯霉素抗性基因标记P2（P2^cat）以检测质粒的转移。在口服感染模型中，供体沙门氏菌P2^cat最初定植于肠腔，并侵染宿主组织（图2a,b）。当用环丙沙星去除肠道菌，组织相关沙门氏菌P2cat持留菌能够存活下来，8天后，引入缺乏P2的沙门氏菌ATCC 14028S菌株作为受体菌（图3）。获得质粒的受体菌，即转化接合子（transconjugant）能够在供体菌恢复生长的1至3天内取代受体菌（图2c）。对照实验证明了P2本身并不能介导质粒转移，且P2cat的转移发生在肠道内并通过接合作用传播。非侵入性供体突变体则显示了供体细胞源于组织相关性沙门氏菌P2^cat持留菌的储存库（reservoir）（图2c-e）。然而这些结果并不能排除少量持留菌残存于肠腔内的可能性。

图2 肠道组织相关的沙门氏菌持留菌是接合质粒的储存库

图3 研究沙门氏菌接合作用的模型菌株

为确认组织相关性沙门氏菌持留菌储存库的重要性，作者利用静脉注射感染模型进行了验证（图4a,b）。该结果与之前研究一致，当腹腔注射头孢曲松后，沙门氏菌P2^cat在脾脏和肝脏中形成了大量的持留菌菌落（图4c,d）【4】。与口服模型相比，在第5天只观察到极少的沙门氏菌P2^cat在肠道定植。然而，当供体菌在肠腔中检测到时，转化接合子随即在1到3天内高效形成（图4e）。与野生型沙门氏菌P2^cat相比，缺乏一种关键毒力因子（既能促进体内病原体的系统生长，又能促进持留菌的存活）的供体菌产生明显较小的持留菌储存库，并且不能产生转化接合子。这些结果说明组织相关性沙门氏菌持留菌能够作为储存库促进接合质粒的传播。

图4 系统性位点的持留菌是肠道内质粒转移的储存库

质粒转移动力学可能由三个关键参数决定：一是携带质粒的供体菌重新进入肠腔并进行初始接合作用（re-seeding，以下称为重定植）的速率，这个过程依赖于持留菌储存库的大小；二是质粒从转化接合子转移至受体菌的速率；三是转化接合子与受体菌的相对生长速率。为探究转化接合子在体内形成的限速步骤，作者首先评估这三个过程的速率。利用携带有5种DNA标签的P2^cat的供体菌（沙门氏菌P2^cat tag）混合物，在口服模型中，作者发现在接种物、第1天的粪便和第15天的粘膜层中，所有的标签均以大致相当的丰度存在，大多数转化接合子仅含有5个标签中的1到2个。在静脉感染实验中，大多数转化接合子仅包含一种标记。因此说明，转化接合子群体源于极少量供体-受体接合事件，随后质粒由转化接合子向受体菌传播。

为量化供体再次定植和质粒接合的相对贡献，作者建立了一个数学模型，分别评估供体重定植的比例与转化接合子到受体接合比例之间的相互依赖性。将该数学模型与质粒标签的分布进行拟合，发现供体重定植过程是限速步骤。更进一步研究中，作者利用这个数学模型预测降低供体重定植的效果，当固定转化接合子到受体接合的参数，降低供体重定植至100倍时削弱了接合作用。随后，作者通过口服接种杀死的沙门氏菌细胞（疫苗），以降低沙门氏菌对肠道组织的定植，发现与野生型小鼠相比，免疫后的小鼠的持留菌储存库的规模小了10到500倍，表明疫苗阻止了小鼠中绝大多数质粒的转移，且转化接合子出现的更晚。这一结果与数学模型预测结果一致，确认了组织相关性的持留菌储存库大小是驱动转化接合子增多的关键因素，也说明了接种疫苗是抑制粘液相关性接合质粒储存库形成的预防方法。

进一步研究中，作者以P2^cat转移至大肠杆菌8171菌株为例，探究其它菌株是否能够获得这些接合质粒。作者首先构建了具有氨苄青霉素抗性（Amp^R）且无P2质粒的大肠杆菌8178衍生物，将其作为口服感染模型的受体菌，结果表明发生了有效的质粒转移。随后，作者以具有卡那霉素抗性（Kan^R）的沙门氏菌SL1344变体感染小鼠后，用环丙沙星和氨苄霉素处理，之后引入Amp^R和Cm^R的大肠杆菌8171 P2^cat供体，结果发现沙门氏菌重新定植于肠腔且有转化接合子形成。因此，组织相关性沙门氏菌持留菌能够作为供体菌，或肠杆菌科（Enterobacteriaceae）不同菌种间质粒转移的受体菌。

为了研究粘膜相关沙门氏菌是否也能作为储存库，介导临床相关编码超广谱β内酰胺酶（ESBL）家族基因的质粒的转移，作者以沙门氏菌SL1344 pESBL15作为供体菌，之后用卡那霉素处理，并用Kan^R和Amp^R的沙门氏菌1428S aphT作为受体菌。结果发现，组织相关持留菌再次定植于肠道，并发生了有效的质粒转移。因此，该发现适用于临床重要的耐药质粒，且在口服感染模型中，不同阶段口服抗生素的种类对质粒快速转移的影响不大。

最后，为了研究静脉注射模型中耐药性质粒向大肠杆菌的转移，作者用沙门氏菌P2^cat静脉注射感染小鼠，结果在内部器官中均发现持留菌。这些持留菌能够重定植于肠道，并将质粒转移至腔内受体菌，在抗生素选择不存在的情况下形成＞25%的大肠杆菌转化接合子。因此，组织相关的沙门氏菌持留菌能够作为耐药质粒的储存库，并在肠杆菌科不同菌种间有效转移。

综上，该研究揭示了抗生素的存在促进了抗性质粒的转移，尤其是促进了肠腔生态位中共存的供体菌和受体菌间抗性质粒的转移。同时揭示了临床细菌感染持久性的原因——细菌的持续存在不仅会导致慢性感染疾病的复发，并且能够促进耐药性的传播。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1521-8

制版人：珂

参考文献

1. Parisi, A. et al. Health outcomes from multidrug-resistant Salmonella infections in high-income countries: a systematic review and meta-analysis. Foodborne Pathog. Dis. 15, 428–436 (2018).

2. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O. & Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nat. Rev. Microbiol. 14, 320–330 (2016).

3. Crump, J. A., Sjölund-Karlsson, M., Gordon, M. A. & Parry, C. M. Epidemiology, clinical presentation, laboratory diagnosis, antimicrobial resistance, and antimicrobial management of invasive Salmonella infections. Clin. Microbiol. Rev. 28, 901–937 (2015).

4. Monack, D. M., Bouley, D. M. & Falkow, S. Salmonella typhimurium persists within macrophages in the mesenteric lymph nodes of chronically infected Nramp1+/+ mice and can be reactivated by IFNγ neutralization. J. Exp. Med. 199, 231–241 (2004).

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