Nature | 背靠背揭示了癌症和代谢紊乱重要治疗靶点ATP-柠檬酸裂解酶的全酶结构

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撰文 | 亦初

责编 | 兮

三羧酸循环是三大营养素（糖类、脂类、氨基酸）代谢的共同通路，也是糖类、脂类、氨基酸合成和转化的枢纽。ATP-柠檬酸裂解酶（ACLY）是连接葡萄糖分解代谢和胆固醇、脂肪酸合成代谢过程中最为关键的酶（图1）【1】，在ATP和辅酶A（CoA）存在下能催化细胞质中的柠檬酸生成乙酰辅酶A和草酰乙酸。我们知道乙酰辅酶A不仅是胆固醇和脂肪酸从头合成的重要原料，还是蛋白质乙酰化修饰反应的底物。

图1 ACLY作为脂代谢过程的中心酶

有意思的是ACLY在肝癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌和胃癌等多种癌症中蛋白表达量增加，敲低或抑制ACLY的酶活可使癌细胞生长受阻，因此乙酰辅酶A的代谢调控有望成为肿瘤治疗的又一手段（详见：Cell Metabolism丨钦伦秀团队揭示乙酰辅酶A代谢在肝癌转移中的重要作用）。由此可见ACLY是抗肿瘤药和降脂药的重要靶点（图2）。自1990年就开始开发ACLY抑制剂，然而仅有用于高胆固醇血症治疗的Bempedoic acid进入了临床III期【2】。我们知道蛋白质的三维结构是靶向药物设计的基础，但ACLY全酶四聚体的结构仍未取得突破。

图2 ACLY抑制剂调控脂代谢的作用机制

近日，来自美国哥伦比亚大学大学生物科学系的Liang Tong团队和比利时根特大学（比利时学术排名第一的综合性研究型大学）生物化学与微生物系的Kenneth Verstraete团队分别在Nature上发表了题为An allosteric mechanism for potent inhibition of human ATP-citrate lyase和Structure of ATP citrate lyase and the origin of citrate synthase in the Krebs cycle的研究工作，他们报道了ACLY全酶四聚体的三维结构，设计出了高亲和力的变构抑制剂，并揭示了还原型和氧化型三羧酸循环中柠檬酸合酶的演化。

人类ACLY蛋白含有1101个氨基酸，可分为6个结构域（图3）；

图3 ACLY结构域示意图

结构域1能结合CoA、结构域2中的His760磷酸化是催化反应的关键位点、结构域3和4形成的ATP折叠能结合ATP、结构域5能结合柠檬酸、而位于羧基端的结构域6氨基酸序列与柠檬酸合酶（CS）则有微弱的同源性。480kD的ACLY蛋白复合物是由同四聚体组成，整个柠檬酸裂解反应经由四步催化完成（图4）。

图4 ACLY的生化反应机理

早先只解出了前五个结构域（1-820个氨基酸）的结构，但它不能形成四聚体，也没法完成柠檬酸裂解完整的反应，得到的结构信息有限。

Liang Tong团队和Nimbus Therapeutics（专注于研发代谢紊乱、肿瘤和免疫等疾病的小分子药物）公司筛选到人类ACLY高亲和力的抑制剂（2-羟基-N-芳香基苯磺酰胺类，NDI-091143半抑制浓度IC50为2.1 ± 0.3 nM，之前的抑制剂如2-hydroxy-N-arylbenzenesulfonamides IC50为130 nM）。发现该化合物能显著提高ACLY蛋白全长或N端蛋白（1-820aa）的稳定性。接着他们用冷冻电镜技术cryo-EM解析了ACLY全酶四聚体的三维结构，总体分辨率3.67埃，N端片段结构分辨率为4.11埃，四聚体的结合中心分辨率更是达到3.2埃（图5）。

图5 ACLY全酶的四聚体结构

通过结构可以看出ACLY四聚体是通过催化中心结构域CS（citryl-CoA转变成OAA和乙酰辅酶A）的α螺旋紧密结合形成了四个原聚体，蛋白N端位于外围；Citryl-CoA在一个原聚体N端柠檬酸和CoA结合结构域形成，然后转位到另一个原聚体CCLY活性位点完成催化反应，该结构也解释了ACLY只能在四聚体形式才能完成整个反应的原因。

通过结构分析发现NDI-091143结合在ACLY的柠檬酸结构域（上图标蓝色的结构域5部分）的疏水小室中（与柠檬酸的结合位点不同），有意思的是该结合使ACLY产生了变构效应，结合后结构发生了较大的变化，使得Ile344的侧链移动约6 埃，这正好位于柠檬酸结合位点，从而阻断了柠檬酸的结合；识别柠檬酸的Arg379胍基移动了约12 埃，使其不能识别柠檬酸，从而使柠檬酸不能与ACLY结合。在复合物中NDI-091143与柠檬酸结构域有广泛相互作用，如酚羟基氧原子与Gly380的酰胺N形成氢键，磺酰胺的酰胺基团与Arg378的羰基形成氢键，三个苯环与ACLY形成广泛的范德华相互作用。该机制的发现极大地增强了ACLY的可成药性，为开发治疗癌症和代谢紊乱的药物提供奠定了坚实的基础。

Kenneth Verstraete团队解析了自养生物如泥生绿菌（C. limicola，分布于无氧、含硫化氢的水体中呈杆状、卵状或弧状、不运动和不放氧光合的细菌）和嗜热栖热菌（H. thermophiles，能在45℃或45℃以上，pH值在3.0以下的环境中生长能氧化亚铁、元素硫、还原态无机硫化物和硫化矿物的耐热嗜酸细菌），古菌选如产甲烷菌（M. concilii，能够将无机或有机化合物厌氧发酵转化成甲烷和二氧化碳的古细菌），异养生物如人类ACLY的晶体结构（图6）。

图6 ACLY的演化

三羧酸循环分为自养生物的还原型（三羧酸循环逆向进行，将二氧化碳中的碳原子还原为有机物）和异养生物的氧化型（把有机物碳原子氧化成为二氧化碳）（图7）。

图7 还原型（左）和氧化型（右）三羧酸循环

通过比较柠檬酸合酶 (citrate synthase, CS) 和柠檬酰-CoA裂解酶（citryl-CoA lyase, CCL）的DNA序列不能明确它们的演化关系，有意思的是通过它们的晶体结构可以清楚的看出氧化型三羧酸循环的第一个酶柠檬酸合酶 (CS) 是从还原型三羧酸循环的柠檬酰-CoA裂解酶（CCL）演化而来（图8）。

图8 柠檬酰-CoA裂解酶（CCL）的演化

两篇文章各有亮点，第一篇用冷冻电镜解析了新开发的ACLY强效小分子抑制剂的结合位置及机理，这给在低分辨率的电镜结构中识别小分子提供了一种强有力的方法；第二篇文章则用传统的晶体学方法解析了ACLY的结构，并明确了柠檬酸合酶(CS)柠檬酰-CoA裂解酶（CCL）的演化关系，为氧化型三羧酸循环的演化提供了新的见解。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1094-6

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1095-5

制版人：珂

参考文献

1.Pinkosky SL, Groot P, Lalwani ND, Steinberg GR: Targeting ATP-Citrate Lyase in Hyperlipidemia and Metabolic Disorders. TRENDS MOL MED 2017, 23,1047-1063.

2.Ray KK, Bays HE, Catapano AL, Lalwani ND, Bloedon LT, Sterling LR, Robinson PL, Ballantyne CM: Safety and Efficacy of Bempedoic Acid to Reduce LDL Cholesterol. N Engl J Med 2019, 380,1022-1032.

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