专家点评Mol Cell | 陈玲玲组首次提出相分离促进新生成rRNA前体定向转运的模型

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点评 | 刘光慧（中科院生物物理所）

责编 | 兮

人类发现核仁 (nucleolus) 已有200多年，直到近几十年才对核仁展开了初步的探索。核仁是哺乳动物细胞核内最大的无膜细胞亚结构（nuclear body），其主要功能是产生并加工核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA），从而形成成熟的核糖体，参与蛋白质的翻译。核仁围绕含有核糖体DNA（ribosomal DNA，rDNA）重复序列的染色质组装而成，这些染色质区域被称为核仁组织区（nucleolar organizer regions，NORs）【1】。核仁具有三个亚区域，分别被称为纤维中心（fibrillar center，FC），致密纤维组分（dense fibrillar component，DFC）以及颗粒组分（granular component，GC）【2】。通常认为，rDNA在FC区域经由RNA聚合酶I（RNA polymerase I，Pol I）连续不断的转录形成大量的rRNA前体，rRNA前体进入DFC区域进行加工，而后进入GC区域装配，最终转运出细胞核组装形成成熟的核糖体【2】。长久以来，对核仁的原位（in situ）研究多基于电子显微镜，然而由于核仁结构致密而精细、电子密度高的特性以及电子显微镜在观测单种蛋白的定位上不具有荧光显微成像的优势，目前人们对核仁亚结构的细节知之甚少。也正是这些研究手段的局限性使得rRNA转录的具体位点的确定与rRNA前体47S的具体定位存在长久的争议 【3】。另外，rRNA的转录高度活跃，占到了整个细胞内转录活性的70%以上，大量产生的rRNA前体必须被快速加工以防止其在转录位点的堆积。然而，目前人们对rRNA前体被快速转运进入DFC区域进行后续加工的机制几乎完全未知。

2019年9月17日，中科院上海生物化学与细胞生物学研究所陈玲玲团队在Molecular Cell杂志上以长文的形式在线发表了题为Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus的文章，系统解析了人类核仁的超微三维结构以及rDNA的排布，首次提出了相分离（phase separation）促进新生成rRNA前体定向转运的模型，并发现了rRNA前体定向转运过程可以促进核仁DFC的组装（图1）。

图1

本研究中，研究者首先利用结构照明显微技术（structured illumination microscopy，SIM），详细研究了核仁的亚显微结构。SIM是通过调制照明光，并通过傅里叶变换将空间域和频域进行变化从而增加分辨率的一种超高分辨率显微技术（super resolution microscopy）【4】。利用SIM，研究者在多种人类细胞中观察到了更加清晰和更多细节的核仁结构：人类核仁包含镶嵌于GC当中的数十到上百个由DFC围绕FC构成的FC/DFC转录单元（图2A），用于转录产生并加工rRNA前体。活细胞SIM成像显示的核仁中FC/DFC转录单元数量远高于电镜观察到的结果，并发现Pol I聚集于FC边缘处，并非过去猜测的均匀分布于FC区域（图2B）。之前研究发现，细胞核内存在活跃的核仁组织区与非活跃的核仁组织区，核仁只围绕活跃核仁组织区形成并产生rRNA【1】。而研究人员利用SIM发现，活跃核仁组织区中实际包含了活跃转录的rDNA与非活跃的rDNA，FC/DFC转录中心只会在活跃rDNA上形成，并且观察到活跃的rDNA主要存在于FC与DFC的交界处，该观察与Pol I聚集于FC边缘处相吻合。通过随机光学重建显微技术（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）和生物化学定量手段，研究者确定了一个FC/DFC转录单元中含有2-3个拷贝的活跃rDNA（图2C）。进一步，研究者利用SIM，受激发射损耗荧光显微技术（stimulated emission depletion microscopy，STED）以及数学建模，首次发现了核仁DFC区域的rRNA加工因子并非均匀分布，而是规律地围绕FC聚集为18-24个簇状结构（图2D）。

图2

对于rRNA前体的转录位点以及rRNA前体的定位的研究，长久以来主要基于免疫电镜，难以对多个特定结构的相对定位进行细致研究。这里研究者利用单分子荧光原位杂交（Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization，smFISH）标记单个的rRNA前体分子，分别标记了其1-414 nt以及498-977 nt部分（需要注意的是，rRNA前体第一步剪切发生在414nt的位置）（图3A）。结果显示，rRNA前体前414 nt主要定位在DFC区域而后续部分（498-977 nt）主要定位在FC边界区域（图3B）。同一条分子具有不同的空间定位，这一现象说明rRNA前体在转录时，其前414nt部分会快速进入DFC区域，而后续部分依然在FC边界处继续转录，这是一个快速的空间转运过程（sorting），直接解释了长久以来基于电镜的研究对rRNA前体的转录位点以及rRNA前体的定位的争议。研究者针对这一现象，进行了对调控这一过程的因子的筛选，发现了核仁蛋白Fibrillarin（FBL）在这一过程中起到了关键性的作用。FBL是rRNA前体加工过程中的一种重要的加工因子，包含了一个富含甘氨酸和精氨酸的内在无序区域（intrinsically disordered regions，IDRs）结构域（GAR）以及一个甲基转移酶结构域（MD）。研究者发现，FBL的GAR与MD两个结构域对rRNA前体的加工都是至关重要的，并且这一加工过程并不依赖于FBL的甲基转移酶活性。MD是具有RNA结合位点的结构域，会直接影响rRNA前体的加工过程不难理解，但是为何具有IDR的GAR也具有促进加工的功能呢？

图3

研究者发现，GAR结构域可以使得FBL在DFC内变得更固态化，自然而然，研究者将视野投向了相分离。蛋白质或者核酸分子可以通过多价相互作用（multivalent interaction），在原本均一的环境中产生物理化学性质不同的另一相，形成无膜细胞器或者是细胞结构，这一过程称之为相分离。IDRs之间的多价结合作用可以介导具有IDR的蛋白发生自相关（self-association）从而促进相分离的形成 【5】。研究者首先利用体外相分离技术，成功观察到了rRNA前体的1-414nt部分可以迅速进入FBL相分离液滴内（视频1），并且这种分选过程是依赖于这段rRNA前体的高级结构，其中，rRNA中由第38-166nt形成的茎环结构尤为重要（图4A, 4B）。深入研究发现，GAR结构域中IDR的长度决定了FBL自相关强度，并直接影响了FBL对rRNA前体的定向转运能力。总体而言，GAR结构域中的IDR越长，FBL的自相关特性越强，对rRNA前体的分选能力也越强（图4C）。接下来，研究者在细胞内同样证实了GAR结构域中IDR的长度与FBL的自相关能力直接关联，并影响了rRNA前体定向转运的过程（图4D）。这一对定向转运的影响也直接影响了rRNA前体的加工（图4E）。更为重要的是，通过将GAR结构域替换为完全人工合成的随机IDR序列，研究者证实了FBL对rRNA前体的定向转运以及加工的促进作用是由GAR结构域中IDR的无序特性决定，而与其序列特性或结构特性无关。

视频1

图4

最后，研究者在实验中发现，被削弱了定向分选rRNA前体能力的FBL突变体形成的DFC区域更小，其中的簇状结构也更少（图5A），于是猜测rRNA前体的定向转运是否会影响DFC区域的组装。通过体外相分离实验，研究者发现，能被定向分选的rRNA能显著增大FBL相分离液滴的尺寸大小。在细胞内，研究者设计了基于CRISPR-dRfxCas13d的蛋白-RNA结合阻碍系统，在不影响rRNA前体加工的条件下，通过阻碍FBL与rRNA前体结合来抑制FBL对rRNA的定向转运。结果发现在阻碍了rRNA前体定向转运过程之后，DFC区域从球壳状结构坍塌为了实心的球状结构（图5B），证实了rRNA前体的定向转运过程可以促进核仁DFC区域的组装。

图5

由于实验手段的局限性，长久以来，人类活细胞核仁精细结构不甚清楚，rRNA转录发生位置以及rRNA前体定位也模棱两可。该研究细化了人类核仁亚显微结构的模型，首次观察到了活跃NORs内的处于活跃与非活跃状态的两种rDNA，发现了DFC区域是非均一结构，并首次利用超高分辨率显微镜在细胞原位确定了rDNA转录位点、rRNA前体的精细定位，以及rRNA前体在FC/DFC转录单元内具有快速定向转运的特性。在细胞内，RNA是如何被正确定位到正确位置进行后续加工或发挥功能的机制鲜有研究，该研究提出由蛋白IDR介导的自相关特性可以促进相分离从而促进rRNA从其转录位点定向转运进入DFC区域进行后续加工这一概念，为RNA定位调控机制的研究提供了新的思路。除核仁外，细胞内还存在大量的无膜细胞亚结构，并且认为RNA、转录以及相分离都可以促进无膜细胞亚结构的形成。该研究发现rRNA定向转运过程可以促进核仁DFC区域的组装，丰富了对无膜细胞亚结构组装机制的认识。

值得一提的是，本文是继2017年对长非编码RNA SLERT与DDX21环状结构在核仁内共同调控Pol I转录活性的文章后【6】(详见BioArt报道：陈玲玲组Cell首次发现调控RNA聚合酶转录的lncRNA—附专家点评丨BioArt特别推荐) ，陈玲玲团队的又一篇关于核仁的研究，而本文的第一作者也是2017年Cell文章的共同第一作者。另外。本文是少有的同时用到了SIM，STED，STROM三大超高分辨率成像技术，并运用了smFISH，相分离技术，FRAP，FRET等多种成像实验手段的研究性论文，非常值得借鉴参考。

该工作中，中科院上海生物化学与细胞生物学研究所的博士生姚润文与博士生许光为共同第一作者，陈玲玲研究员为本研究论文的通讯作者。该研究受到了中科院上海营养与健康研究所杨力研究组，中科院植物生理生态研究所公共技术服务中心、国家蛋白质科学中心（上海）复合激光显微成像系统、中科院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞分析技术平台，上海科技大学免疫化学研究所影像平台，中科院深圳先进技术研究院储军副研究员，GE Healthcare Life Sciences（上海）、Leica Microsystems（上海）、Nikon instruments （上海）的大力支持。

陈玲玲研究员简介

2009年毕业于美国康涅狄格大学医学院获生物医学博士学位，同时获商学院工商管理学硕士学位。同年5月作为独立PI获得Connecticut Stem Cell Seed Award研究经费资助，受聘于康涅狄格大学干细胞学院从事博士后研究，并于2010年5月任助理教授。2011年1月任上海生化与细胞所研究员。目前担任国际期刊Trends in genetics、Genome biology、Journal of Biological Chemistry编委。2017年入选为霍华·德休斯医学院研究所（HHMI）国际研究员、入选国家杰出青年科学基金，获谈家桢生命科学创新奖；2016年入选全球华人生物学家协会CBIS杰出青年研究员奖、中国青年女科学家奖等荣誉。

陈玲玲研究团队长期从事环状RNA与细胞核亚结构中非编码RNA的研究。环状RNA方面，陈玲玲团队与杨力研究员团队合作，发现了两类环形RNA家族（Mol Cell, 2013）（Cell, 2014），揭示了它们全新的生成加工过程 (Cell, 2014)、在基因表达调控中的作用（Cell Rep, 2016）以及与人类疾病密切的关联 (Mol Cell, 2017) (Cell, 2019)。在细胞核亚结构方面，陈玲玲团队主要以核仁 (Cell，2017) (Mol Cell，2019)，Paraspeckles (Genes & Dev, 2015) (Nat Cell Biol, 2018)，PWS小体 (Mol Cell, 2012) (Mol Cell, 2016) 为研究对象，深入研究了各类细胞核亚结构中非编码RNA的功能作用以及相关机制。

专家点评

刘光慧（中科院生物物理所）

核仁作为细胞内最大的无膜细胞器主要由rDNA、rRNA和核糖核蛋白组成。根据电子致密程度高低，核仁可以分为纤维中心（FibrillarCenter，FC）、致密纤维组分（Dense Fibrillar Component，DFC）以及颗粒组分（Granular Component，GC）三个独立的核仁亚区域。现有模型认为核糖体首先在FC区域内组装，通过RNA 聚合酶II（Pol II）介导的rDNA转录生成47s rRNA，而后者在DFC区域被切割后生成28s、18s和5.8s rRNA。这些较短的rRNA随后被小核仁核酸蛋白(snoRNP)修饰。最后在GC区域与核糖体亚基单位一同组装后被转运至细胞质中。以往对核仁的原位研究多基于电子显微镜，该研究手段存在很大的局限性，使得核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）转录具体位点的确定与rRNA前体47S的定位长期存在争议。另外大量产生的rRNA前体需要快速加工以防止其在转录位点的堆积，而目前人们对rRNA前体快速转运进入DFC区域进行后续加工的机制几乎完全未知。

近年来，随着生物学技术的迅速发展，核仁的新功能逐渐被揭示。2016年6月，Cell杂志首次报道由于表面张力和粘度等特性相异，核仁的组成蛋白和RNA通过相分离（Phase separation）能自发地将自身装配成三个不同的相，将相分离的概念引入核仁组织的研究领域，为进一步揭示核仁的装配和组织提供了新的方向。2019年7月，Science杂志报道核仁通过相分离实现错误折叠蛋白的修复。在应激条件下，错误折叠的蛋白质进入核仁GC区域，与核仁蛋白（如NPM1）结合，呈相分离状态，避免了错误蛋白的不可逆聚集。2017年8月，Nature Communications杂志报道较小的核仁可以作为个体长寿在细胞水平检测的一项指标。因此，核仁的结构及其功能的维持对于细胞的基本生理功能、细胞衰老及恶性转化等过程均至关重要。然而，受限于核仁区结构的致密性及其高电子密度的特性，人们尚无法窥探核仁亚区域的精细结构。迄今为止，仍无法完全理解新生RNA如何在细胞中定向移动，新生的前体核糖体RNA（pre-rRNA）如何进入DFC区域进行后续加工从而行使诸多生物学功能。

日前，Molecular Cell在线发表了陈玲玲研究组关于核仁区精细结构以及新生的pre-rRNA定向转运的重要成果“Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus”。该研究基于其团队2017年在Cell上发表的长非编码RNA SLERT 在细胞核仁功能和RNA聚合酶I (Pol I) 转录过程中的作用机制的研究成果，进一步研究阐释了核仁结构及功能。值得关注的是该研究同时采用了三种超高分辨率成像技术：结构照明显微技术（Structured Illumination Microscopy），受激发射损耗荧光显微镜（Stimulated Emission Depletion Microscopy）和随机光学重建显微法（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy），系统地对人细胞内核仁区域的亚显微结构进行了精细解析。研究人员首次利用超高分辨率显微镜观察到了活跃的核仁组织区（Nucleolar Organizer Regions，NORs）内存在处于活跃和沉默两种状态的rDNA，发现了DFC区域是由规律地围绕FC区域聚集为18-24个簇状的结构所组成，并非均一的结构；首次利用超高分辨率显微镜在细胞原位确定了rDNA的转录位点、pre-rRNA的定位以及其在FC/DFC转录单元内的快速定向转运；并首次从相分离的角度对RNA在细胞内被定位到正确位置进行加工或发挥功能的机制进行了探究，提出了相分离促进新生成pre-rRNA定向转运的模型，同时发现了新生pre-rRNA的定向转运可以促进DFC的组装，从而为RNA定位调控机制的研究提供了新思路，也为深入认识细胞内无膜细胞器的装配和时空分布提出了新观点。该研究堪称核仁研究领域的又一奠基之作，也是相分离相关研究领域的一项重要进展，将为进一步揭示核仁在诸多生理或病理过程，如胚胎发育、肿瘤的发生发展、神经系统疾病的发生、衰老与寿命调控等提供理论支撑和技术支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.08.014

制版人：珂

参考文献

1. McStay, B., and Grummt, I. (2008). The epigenetics of rRNA genes: from molecular to chromosome biology. Annu Rev Cell Dev Biol 24, 131-157.

2. Boisvert, F.M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., and Lamond, A.I. (2007). The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 574-585.

3. Huang, S. (2002). Building an efficient factory: where is pre-rRNA synthesized in the nucleolus? J Cell Biol 157, 739-741.

4. Schermelleh, L., Ferrand, A., Huser, T., Eggeling, C., Sauer, M., Biehlmaier, O., and Drummen, G.P.C. (2019). Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol 21, 72-84.

5. Shin, Y., and Brangwynne, C.P. (2017). Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science 357.

6. Xing, Y.H., Yao, R.W., Zhang, Y., Guo, C.J., Jiang, S., Xu, G., Dong, R., Yang, L., and Chen, L.L. (2017). SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription. Cell 169, 664-678 e616.

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