Neuron | 谢晓军等揭示调控睡眠神经回路的分子机制
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睡眠是一种重要的动物行为。众所周知，睡眠不足和缺失会造成认知（学习和记忆）能力的下降。睡眠行为看似简单，其背后却伴随着丰富的生理指针的规律变化（意识、脑电波、肌肉张力、感官等等），并受到包括生物钟、稳态控制、外部环境因素等多方面的调节。对于各种调节机制的发生和整合，各种生理变化的控制和平衡，以及最终睡眠行为的执行，大脑都发挥着不可替代的作用。
然而，大脑中的神经回路是如何具体执行睡眠相关的功能呢？遗传与环境因素是如何在发育过程中塑造这些回路的形成，并产生物种间和个体间的睡眠行为的差异性的呢？对于这些问题的答案，我们知之甚少。幸运的是，睡眠是一种最为保守的动物行为。人和哺乳动物需要睡眠，昆虫、线虫甚至于水母这些“低等动物”也都具有睡眠或类似睡眠的行为【1】。因此，利用小鼠、果蝇等各种模式动物，我们可以对控制睡眠的分子机制、睡眠行为背后的细胞生物学和神经生理学机理，进行深入细致的研究【2】。
2019年9月26日，美国约翰霍普金斯大学的Alex Kolodkin教授（浙江大学医学院附属儿童医院的谢晓军副研究员为第一作者）在Neuron杂志上发表题为 Semaphorin 2b regulates sleep-circuit formation in the Drosophila central brain 的文章。该文的研究者发现了果蝇大脑中与睡眠惊醒阈（arousal threshold）调控相关的新的神经回路，并解析了这些神经回路所具有的特定的三维结构（神经分层）在发育过程中如何受到外在Semaphorin信号分子的调节。
神经系统功能的正常发挥，依赖于神经元之间的精确连接，其中主要包括发生在神经突起（轴突与树突）之间的突触连接。在中枢神经系统中， 这些神经突起及神经连接往往具有高度的空间组织性 。比如，果蝇大脑中的中心复合体（Central Complex）神经回路具有复杂而有序的三维结构组织方式，参与包括睡眠在内的多种动物行为的控制【3】。因此，近年来，中心复合体开始成为研究高级神经中枢结构功能相关性的重要模型。
本文中，作者首先概述了中心复合体中的不同亚结构，已知与睡眠调控相关的神经元的轴突和树突沿背腹轴的分层分布，以及特定神经元的神经突起沿左右体轴的柱状分布。随后作者重点研究了伞型体（Fan-shaped body）神经分层（从腹部到北部分为1-9层）的发育机制。
Semaphorin是一类保守的，包含转膜蛋白和分泌蛋白的蛋白家族，在动物发育的多个阶段发挥重要功能 【4】。果蝇基因组已知编码两个分泌型（Sema-2a和Sema-2b) 和3个转膜型的Semaphorin。其中Sema-2b特定地表达在伞型体的中部（3-5层），提示Sema-2b可能介导伞型体的分层发育。作者利用Sema-2b的突变体，并通过RNA干扰（RNA interference) 技术特异性地敲低Sema-2b，发现一类简称P-Fr的神经元在伞型体中的分层投射发生特异性的改变。P-Fr神经元同样投射到伞型体3-5层，但它们自身并不表达Sema-2b。通过一系列的Sema-2b缺失和异位表达实验表明，Sema-2b作为一种外源因子，通过正向吸引作用，调节P-Fr神经元在伞型体中的分层分布。
Sema-2b的已知受体是转膜蛋白Plexin B（PlexB）。PlexB突变体与Sema-2b突变体都具有类似的伞型体形态和分层的变化。为了验证Sema-2b是否通过PlexB直接作用于P-Fr神经元。作者利用更为精细的遗传操作，在P-Fr神经元中阻断PlexB信号通路，同时标记P-Fr神经元和相邻分层神经元，来解析PlexB对P-Fr神经元在伞型体中神经投射分布的影响。结果显示，当PlexB通路在群体或单一P-Fr神经元中被阻断时，都产生类似的去分层现象（P-Fr神经元进入第6层），表明PlexB介导了P-Fr神经元的分层分布。
神经分层现象在中枢神经系统中广泛存在，然而其具体功能尚未可知。一种观点认为，神经分层帮助神经突起形成正确的三维结构和分布，利于其形成精确的神经连接；另一种观点认为，神经分层可能只是神经发育过程中的“副产品”，其现象本身并不对神经回路的形成起重要作用。为了揭示伞型体中的神经分层是否具有功能上的相关性，作者在发育和结构研究的基础上，进一步验证了P-Fr神经元的分层改变是否影响其神经连接和功能。通过GRASP（GFP Reconstitution Across Synaptic Partners）， 光遗传学和ex vivo GCaMP双光子成像技术，作者发现阻断PlexB引起的P-Fr神经元去分层，会导致P-Fr神经突起与第6层的ExFl2神经元的轴突之间形成特异的单向抑制性突触连接（ExFl2抑制P-Fr）；通过果蝇睡眠行为学的研究，作者发现激活或是抑制P-Fr神经元活性，会相应的增加或是减少被外部震动刺激所惊醒的果蝇的比例，说明P-Fr神经元参与到果蝇睡眠惊醒阈（arousal threshold）的调节中。更为有趣的是，在发育中的P-Fr神经元中阻断PlexB通路后，果蝇成虫睡眠行为的改变与直接抑制P-Fr神经元活动后产生的变化相似，印证了前文所发现的 P-Fr神经元的去分层会导致抑制性神经输入的增加。
这项研究从神经回路发育的角度详细地探查了果蝇大脑中与睡眠相关的神经回路的分层发育过程和分子机制，寻找到新的与睡眠惊醒阈相关的神经元类型，探明了其神经突起分层与神经突触连接形成的关系和在睡眠行为中的功能相关性。这项研究还提供了新的证据支持神经分层对形成特定突触连接和生理功能具有重要的影响，为将来进一步研究神经回路的三维结构定位与大脑高级认知功能的相互关系提供了新的模型。
制版人：珂
参考文献
1. LESKU, J. A. & LY, L. M. T. 2017. Sleep Origins: Restful Jellyfish Are Sleeping Jellyfish. Curr Biol, 27, R1060-R1062.
2. DUBOWY, C. & SEHGAL, A. 2017. Circadian Rhythms and Sleep in Drosophila melanogaster. Genetics, 205, 1373-1397.
3. PFEIFFER, K. & HOMBERG, U. 2014. Organization and functional roles of the central complex in the insect brain. Annu Rev Entomol, 59, 165-84.
4. JONGBLOETS, B. C. & PASTERKAMP, R. J. 2014. Semaphorin signalling during development. Development, 141, 3292-7.