撰文 | QY责编 | 兮DNA是绝大多数生物的遗传物质，在真核生物中，DNA高度有序地折叠在染色质结构中。作为染色质结构的基本单位，核小体由一段大约150bp的DNA缠绕在一个由H3,H4,H2A,H2B所构成的组蛋白八聚体构成【1】。核小体之间通过一段Linker DNA 连接。核小体进一步在一系列精细的调控手段作用下，反复折叠缠绕形成高度有序的高度压缩状态的染色质结构【2】。但是对于染色质形成的具体机制，以及染色质区室化等现象的形成机制仍不明确。最近的一些列研究表明，细胞内的液液相分离为染色质的结构的调控以及区室化等现象提供的解释【3-5】。2019年9月19日，来自美国西南医学中心的Michael K. Rosen课题组在Cell发表了题为Organization of Chromatin by Intrinsic and Regulated Phase Separation 的文章，从相分离的角度揭示了细胞内染色质结构的调节。另外，同一时间，来自清华大学的李丕龙教授课题组也在Molecular Cell 杂志发表了题为Histone modifications regulate chromatin compartmentalization by contributing to a phase separation mechanism的文章，揭示了组蛋白修饰通过促进液-液相分离调节染色体区室化（详见Bioart报道：Molecular Cell | 李丕龙/李海涛合作报道组蛋白修饰通过促成相分离来调节染色质区室化的新机制）。为了研究染色质能否发生相分离，作者首先利用含有12个重复的Widom’s 601- nucleosome positioning sequence序列的双链DNA片段与纯化的不同物种的以及不同荧光标记的组蛋白八聚体在体外重新组装成核小体结构，模拟体内的染色质结构用于后续的染色质相分离实验。作者发现体外重构的染色质结构能够在生理盐浓度下发生相分离，形成典型的“lipid droplets”,这种droplets符合液滴的各种性质，呈现球形，可以相互融合，能够在荧光漂白恢复，而且这种体外重构的染色质结构的相分离现象随着构成染色质的核小体个数的增长而更加明显。 为了进一步说明体外重构的染色质结构的相分离与核小体个数有关，作者在体外将单个的核小体使用T4 DNA连接酶连接起来成为一串核小体结构，作者发现，单个的核小体结构不能发生相分离，但是经过T4 DNA 连接酶连接后的核小体能够发生相分离现象。作者通过以上实验发现了染色质结构在正常生理浓度的盐离子条件下能够发生相分离现象，并且这种相分离现在依赖于核小体的个数。作者进一步研究了组蛋白的结构对于相分离的影响，作者发现组蛋白的游离在八聚体外面的组蛋白Tail结构，对于相分离现象是必须的，将这段序列使用胰酶消化或者将组蛋白H4的Basic Patch的K16,R17,R19,K20 突变后便不能在发生相分离现象，说明了Histone H4的Basic Patch与DNA的结合对于染色质发生相分离是非常重要的。作者进一步使用FRAP实验检测在发生相分离后的“liquid droplets”里面的蛋白是否是活跃的，即证明不是一种固态的结构确实是一种液滴的结构。作者发现，如果将整个liquid droplets漂白，其恢复速度极其缓慢，但是如果仅漂白一个液滴的部分区域，这部分区域的荧光强度能够非常快的恢复，说明了液滴内部组分之间的流动性，作者进一步测定了在液滴内部以及溶液中的蛋白浓度，作者发现液滴内部的但阿比浓度可以高达340微摩尔，比溶液中的浓度高出了10000倍，这也能解释漂白整个液滴后恢复速度为什么会非常缓慢的问题，溶液中的组蛋白的浓度过于低，导致其整个液滴的荧光恢复非常缓慢。作者在发现体外重构的染色质结构可以发生相分离的现象后，进一步对这种相分离现象在细胞内的可能的调控因素做了详细的研究。首先，在细胞内，核小体与核小体之间的linker DNA上还有Histone H1帮助核小体反复折叠缠绕形成染色质结构，因此，作者首先检测了Histone H1 是否会影响染色质的相分离现象。作者将纯化的Histone H1 加入到体外的相分离体系中，发现Histone H1会显著地促进染色质的相分离现象，在更低的盐离子浓度情况下染色质就能发生相分离现象，另外，Histone H1 的加入会显著增加染色质相分离形成的液滴内部的分子的浓度，并降低内部分子之间的流动性。这一现象可能揭示了之前的研究报道Histone H1的去除会导致染色体更加松散，细胞核体积增大的原因【6】。另外，作者还证实了Histone H1的lysine-rich C-terminal domain（CTD）对于Histone H1的这种调节染色质相分离的现象是充分而且是必须要的，其他的与DNA结合的结构域可能是用于将CTD结构域募集到染色质上。其次，作者研究了核小体之间的linker DNA长度对于染色质发生相分离的影响，根据之前的研究结果，作者检测了10N+5bps 以及10Nbps长度的linker序列对于核小体相分离的影响，作者发现10N+5bps会显著促进相分离发生，而10Nbsp效果较弱。这也在一定程度上揭示了细胞内的核小体之间的DNA长度的10N+5bps的偏向性。另外，这些结果也在揭示了为什么在高等真核生物细胞中表达更多的Histone H1的原因，可能是由于linker序列更长，需要更多的Histone H1来帮助核小体发生相分离。另外，组蛋白在细胞内会经历一些列的翻译后修饰，比如磷酸化、甲基化、泛素化以及乙酰化等修饰。之前的研究表明，乙酰化后的染色质结构一般更为松散，利于基因的转录。作者为了探索乙酰化修饰对于染色质相分离的影响，设计了一个巧妙的实验，作者在核小体串的linker DNA序列中引入了Tet operator 序列，另外设计了一个GFP-TetR-p300Hat的融合蛋白，该蛋白GFP可以被荧光检测，TetR可以将该融合蛋白带到Tet operator 序列上，p300Hat可以在有AcetylCoA的情况下将组蛋白乙酰化。作者发现，在体系中引入该融合蛋白后，在加入了Dox（抑制tetR与Tet operator的结合）情况下，染色质能够发生相分离，在引入了AcetylCoA后，染色质的相分离现象被明显抑制，同时引入AcetylCoA以及Dox的情况下，染色质的相分离现象不受到影响，充分说明了组蛋白的乙酰化修饰能够显著抑制染色质的相分离现象，也就是说可以让染色质结构更为松散，这一结果支持了以前的的研究结果。另外，作者将为被乙酰化的核小体以及被乙酰化修饰的染色质结构通过显微注射的方式打入Hela细胞的细胞核中后发现，为被乙酰化修饰的染色质结构能很好地聚集在DNA致密区域，但是乙酰化修饰的染色质结构散乱分布在细胞核中，说明了体外的相分离现象能够在细胞内重现。最后，作者进一步研究了Multi-bromodomain 蛋白对于染色质相分离的影响，Multi-bromodomain 蛋白能够识别被乙酰化修饰的组蛋白，作者研究了该结构域对于乙酰化后的染色质相分离的影响。作者发现，Multi-bromodomain 蛋白能够显著促进乙酰化的染色质的相分离。作者进一步研究了这种Multi-bromodomain 蛋白诱导的乙酰化的染色质的相分离与未被乙酰化修饰的染色质自身的相分离的区别，作者将两种不同颜色标记的相分离组分组合到一起，发现两种相分离的droplets能够相互靠近，接触，但是并不会完全融合在一起，在体系中形成两种phase，一种phase中是非乙酰化的核小体结构发生的相分离，另一种是Multi-bromodomain 蛋白与乙酰化后的核小体结构发生相分离。有趣的是，作者发现BRD4能够抑制非乙酰化的核小体的相分离现象。这一结果说明了组蛋白的不同的修饰可能为细胞内的相分离现象的调控提供了相应的生物化学基础，也为染色质结构的动态调节，基因组复制，DNA转录过程的调控提供了另外的机制。这篇文章的研究结果于今年1月份发布到bioRxiv上https://www.biorxiv.org/content/10.1101/523662v1.article-info.于五月份投稿到Cell 杂志，对比1月份的相关数据与最后发表在Cell杂志的文章来看，首先文章的标题由Organization and Regulation of Chromatin by Liquid-Liquid Phase Separation改成了Organization of Chromatin by Intrinsic and Regulated Phase Separation，另外，在Cell杂志最终版本中加入了Multi-bromodomain 蛋白对于乙酰化核小体的相分离的调控。标题的变化，以及data的增加，结合最近相分离领域的研究动向，其实可以看出，相分离的研究已经开始从解释细胞内的无膜细胞器等Molecular condensates的物理化学本质逐渐转向细胞内相分离现象的精细调控及其干预手段的研究上。这些研究为我们进一步理解生命现象的本质，对一些疾病的发生发展机制以及相关的干预手段的开发提供了全新的理解和思路。期待相分离领域更多的突破。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.08.037制版人：小娴子
参考文献
1. Kornberg RD. Chromatin structure: arepeating unit of histones and DNA. Science (New York, NY) 1974;184(4139):868-71 doi 10.1126/science.184.4139.868.2. OlinsDE, Olins AL. Chromatin history: our view from the bridge. Nature reviewsMolecular cell biology 2003;4(10):809-14doi 10.1038/nrm1225.3. LarsonAG, Elnatan D, Keenen MM, Trnka MJ, Johnston JB, Burlingame AL, et al. Liquid droplet formation byHP1alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature 2017;547(7662):236-40 doi10.1038/nature22822.4. StromAR, Emelyanov AV, Mir M, Fyodorov DV, Darzacq X, Karpen GH. Phase separationdrives heterochromatin domain formation. Nature 2017;547(7662):241-5 doi 10.1038/nature22989.5. WangN, Liu C. Implications of liquid-liquid phase separation in plant chromatinorganization and transcriptional control. Current opinion in genetics &development 2019;55:59-65 doi10.1016/j.gde.2019.06.003.6. FanY, Nikitina T, Zhao J, Fleury TJ, Bhattacharyya R, Bouhassira EE, et al. Histone H1 depletion in mammalsalters global chromatin structure but causes specific changes in generegulation. Cell 2005;123(7):1199-212doi 10.1016/j.cell.2005.10.028.