独家原创|吲哚胺2，3-双加氧酶-1及其抑制剂的研究进展

2003 年毕业于中国科学院上海有机化学研究所，并获得有机化学博士学位， 2003—2007 年在美国国立卫生研究院国家癌症研究所（ NIH， NCI）从事博士后研究。2008 年归国后 , 任中 国科学院广州生物医药与健康研究院“百人计划”研究员、博士生导师 , 课题组组长。现任中国药科大学教授、 博士生导师、课题组组长。兼任美国化学会会员、美国多肽学会会员、中国化学会会员、中国药学会高级会员。 担任 Scientifc Reports 及《天然产物研究与开发》等杂志的编委等职务。主要从事新药分子的设计与合成及 药物合成新技术开发的研究工作。近年来，作为课题负责人先后主持国家重大新药创制科技重大专项、 973 子课题、国家自然科学基金和省部级科技计划等 10 余项研究工作。申请发明专利 20 余个，已获得授权专利 10 余个，包括国际专利 2 个。被聘为多个国际期刊如 J Med Chem、 Bioorg Med Chem Lett、 Bioorg Med Chem、 Eur J Med Chem、 J Org Chem、 Org Lett 等杂志特约审稿人。近年来共发表 SCI 论文 70 多篇，包括在 Angew Chem Int Ed、 Org Lett、 J Med Chem 等 国际核心期刊上发表的一系列具有创新性的文章。其中，“Single‐ Molecule Force Measurement Guides the Design of Multivalent Ligands with Picomolar Afnity”于 2019 年在国际著名刊物 Angew Chem Int Ed 上发表，并被选为封面文章。

[摘要]吲哚胺2,3-双加氧酶-1是色氨酸通过犬尿氨酸途径代谢的一种关键限速酶。其在多种肿瘤细胞中高表达，介导肿瘤免疫逃逸，与肿瘤的恶性转化以及病人预后差等密切相关。吲哚胺2,3-双加氧酶-1已经成为潜在的肿瘤免疫治疗药物靶点。目前已有许多不同结构的吲哚胺2,3-双加氧酶-1抑制剂被报道，其中多个抑制剂已进入临床研究阶段。综述吲哚胺2,3-双加氧酶-1在肿瘤免疫逃逸中的作用机制以及相关药物研究最新进展，旨在为肿瘤免疫疗法提供新思路。

肿瘤免疫治疗是指激活机体自身的免疫系统或恢复被抑制的免疫反应来对抗肿瘤的一种新兴抗肿瘤疗法。“肿瘤免疫疗法”被美国Science杂志评为2013年度十大科技突破之首。该疗法的研究取得了突破性进展。特别是，阻断细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）、程序性死亡受体-1（programmed cell death protein1，PD-1）/程序性死亡受体配体-1（programmedcelldeathligand1，PD-L1）等增强T细胞抗肿瘤免疫反应的免疫检查点抑制剂，在黑色素瘤、头颈部肿瘤和霍奇金淋巴瘤等恶性肿瘤中取得了显著的临床疗效，如美国FDA于2011年批准的针对CTLA-4的单抗ipilimumab以及2014年批准的针对PD-1的单抗nivolumab和pembrolizumab。然而，目前可用的免疫检查点抑制剂只能使特定的亚群患者受益或对某些类型肿瘤具有抑制效果，且用药一段时间后常出现耐药性；此外这些免疫检查点抑制剂大多为生物类大分子药物，具有成本高、生物利用度低、静脉注射导致病人依从性差等问题。因此，利用小分子药物自身的优良特性，研究与开发小分子免疫检查点抑制剂替代大分子生物药物具有重要意义，而吲哚胺2，3-双加氧酶-1（indoleamine2，3-dioxygenase1，IDO1，EC1.13.11.52）是小分子免疫检查点抑制剂的潜在有效靶点。正常生理条件下，IDO1在机体中低表达，是催化人体必需氨基酸色氨酸（tryptophan，Trp）经过犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）途径代谢的关键限速酶。然而，IDO1在多种恶性肿瘤中异常高表达，造成肿瘤微环境中Trp耗竭和Kyn等代谢产物的增加，明显抑制T细胞的增殖，活化调节性T细胞（regulatory T cell，Treg），抑制抗肿瘤免疫应答，使机体无法对肿瘤细胞进行识别和清除。并且，IDO1的高表达与病人的药物耐药性、肿瘤发展进程和预后差密切相关。因此，抑制IDO1的活性可以有效地抑制肿瘤微环境中Trp的降解，促进T细胞的增殖，从而增强机体免疫系统对肿瘤细胞的攻击能力。另外，IDO1抑制剂还可以增强化疗药物、放疗以及治疗性疫苗的疗效。在2017年美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）年会上，IDO1抑制剂被誉为肿瘤免疫治疗的下一个热点研究领域。本文首先简述IDO1的生理功能、活性调控机制及其在肿瘤免疫逃逸中发挥的作用，并对近期IDO1抑制剂研发过程中面临的挑战进行分析，最后对近期IDO1抑制剂的研究进展进行综述。

1IDO1的功能、活性调控机制及其在肿瘤免疫逃逸中发挥的作用

1.1犬尿氨酸途径的限速酶

Trp是一种含有吲哚环骨架的必需氨基酸，为多种细胞生命活动和正常的生理功能所必需，其体内代谢途径主要有4种：脱羧作用生成色胺、蛋白质的合成、血清素途径和Kyn途径（见图1），其中Kyn途径是体内Trp代谢的主要途径。Kyn代谢途径的第1步是其限速步骤，即将Trp转化为N-甲酰基犬尿氨酸（N-formylkynurenine，NFK），由IDO1、IDO2（EC1.13.11）和色氨酸-2，3-双加氧酶（tryptophan2，3-dioxygenase，TDO，EC1.13.11.11）催化裂解Trp吲哚环的2，3-双键，同时将一个氧分子（O2）融合到此未封闭的分子中完成。NFK在甲酰胺酶的作用下快速转化为Kyn，后者进一步转化为其他活性代谢物，如犬尿胺、3-羟基犬尿氨酸、邻氨基苯甲酸、犬尿烯酸、3-羟基邻氨基苯甲酸以及喹啉酸、吡啶酸和可为细胞代谢提供能量的NAD+和ATP。IDO1、IDO2和TDO虽具有相似的生化作用，但在结构、底物转化率、底物特异性、组织分布和表达调控等方面均存在不同程度的差异。IDO1是由8p12染色体编码生成的一种位于细胞质内的含亚铁血红素的单体蛋白，于1967年首次在兔肠道中发现。IDO1对底物的选择性较低，能够识别L-Trp、D-Trp、血清素和色胺等多种底物。该酶主要负责肝脏外L-Trp的代谢，对L-Trp具有较高的亲和力（Km≈20μmol·L-1）。TDO是4号染色体编码形成的同源四聚体血红素酶，于1936年首次在兔肝脏中被发现，对L-Trp具有较高的选择性，但对底物的亲和力比IDO1低（Km≈190μmol·L-1）。TDO可直接调节L-Trp的水平，以维持体内L-Trp的稳态。IDO1是由INDO基因所编码，而TDO则是由TDO2基因编码，两序列同源性仅有10%，但二者含有亚铁血红素的活性部位相似性很高。IDO2是IDO1的同源物，IDO2由INDOL1基因所编码，二者的基因位于同一条染色体上，INDOL1位于INDO的下游，二者呈现头尾相连的排列方式。虽然编码IDO1与IDO2的基因具有43%的序列同源性，但是IDO2催化降解L-Trp的能力远低于IDO1（Km≈6.8mmol·L-1）。IDO1在肝脏外各组织中均有分布，包括中枢神经系统、肠、胸腺、脾脏、胰腺、胎盘、肾脏、呼吸道、髓细胞和内皮细胞等，且在特定的组织中随着年龄的增长而增加。TDO主要在肝脏、胎盘和大脑中表达，这可能反映了其维持身体能量需求的特殊作用。与IDO1相比，IDO2的分布范围相对较小，在IDO1表达的部分组织中表达，主要分布在肾脏中，其次在附睾、睾丸、肝脏、卵巢、子宫、胎盘中有表达。尽管IDO1和IDO2在多种相同组织中表达，但二者分布在不同类型的细胞中，说明二者具有不冗杂的生物学功能。大量研究表明：IDO1和TDO在多种肿瘤细胞中呈高表达水平，与肿瘤免疫逃逸密切相关；而IDO2在肿瘤细胞中低表达，因而IDO2是否介导肿瘤免疫逃逸尚存争议。虽然3种酶均催化Kyn途径的关键步骤，但现阶段的研究主要集中在IDO1。IDO1被视为最具治疗潜力的抗肿瘤靶点之一。

1.2IDO1的活性调控机制

IDO1的表达和活性受多种因素的影响，包括转录、翻译和降解等过程。在转录水平上主要受以下方式调控：1）核因子活化B细胞κ轻链增强子（nuclear factor κ-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）通路主要涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递，可通过干扰素通路调节IDO1mRNA的表达；2）CCCTC-结合因子（CCCTC binding factor，CTCF）是广泛存在于真核生物中的多功能转录因子，其可以通过启动子和远端增强子区域间的染色质长周期相互作用来介导IDO1的表达；3）特定的树突状细胞（dendritic cell，DC）反应元件与芳氢受体（aromatic hydrogen receptor，AhR）结合，促进Kyn依赖性的IDO1的表达。此外，特定的翻译后调节机制也会影响IDO1酶的活性与半衰期，例如可扩散分子一氧化氮（NO）与IDO1的血红素辅因子结合后产生的Fe3+和NO3-，会导致酶活性的可逆性抑制。另外，内源性NO的产生会促进IDO1的蛋白酶体降解。低氧也会导致INDO基因表达减少，从而减少Kyn的产生。

在蛋白质水平上，IDO1主要受免疫原刺激下蛋白酶体降解系统的调控。IDO1含有2个可磷酸化的酪氨酸残基（Tyr115和Tyr253），残基磷酸化会导致IDO1的构象变化并阻断IDO1的催化活性。除了调节催化活性外，这些残基还可作为多种分子伴侣的停靠点，调节IDO1的半衰期，维持其免疫调节作用或刺激炎症反应。例如，白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）诱导Tyr253磷酸化，从而募集细胞因子信号转导抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）与IDO1形成复合物，促进IDO1被泛素-蛋白酶体系统降解。

1.3IDO1在免疫逃逸中的作用和机制

正常生理状态下，IDO1的表达水平较低，而多种细胞因子可诱导IDO1的表达，包括干扰素-α（interferon-α，IFN-α）、IFN-γ、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、IL-1、前列腺素E2（prostaglandin-E2，PGE2）、转录生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)、肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF），环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）等。2002年，Friberg等首次提出IDO1在肿瘤免疫逃逸中具有重要作用。其研究表明在体外Lewis肺癌细胞（Lewis lung carcinoma，LLC）水平，IDO1抑制剂刺激产生了更强的同种异体T细胞反应，并在体内LLC小鼠模型中延缓肿瘤细胞生长。IDO1在多种肿瘤细胞中异常高表达，与病人生存周期缩短、肿瘤T细胞浸润减少和Treg增多等不良预后密切相关。IDO1介导肿瘤免疫逃逸是综合调节多种免疫细胞的结果，其一方面抑制效应T细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞等免疫杀伤细胞的活性或诱导其凋亡，另一方面促进Treg、髓性抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）等免疫抑制细胞增殖或诱导激活，两方面协同作用产生免疫抑制微环境，使得肿瘤细胞逃脱免疫系统的攻击。如图2所示，IDO1主要通过以下3种作用机制介导肿瘤免疫逃逸，抑制抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤细胞的增殖和生长。

1.3.1Trp耗竭激活应激反应激酶通路IDO1高表达造成局部Trp耗竭，使得转运Trp的tRNA处于游离状态，而一般性调控阻遏蛋白激酶2（general control non-derepressible 2，GCN2）因含有一个感应游离tRNA的变构调节位点而得到激活。活化的GCN2诱导下游真核细胞转录起始因子-2α（eukaryotic translation initiation factor-2α，EIF-2α）磷酸化，从而弱化了EIF-2α的促转录功能，抑制蛋白质合成，进而导致T细胞周期阻滞，抑制浸润性T细胞活化。此外，激活的GCN2也能促进Treg的分化。

1.3.2Trp耗竭抑制氨基酸感应激酶1通路Trp匮乏抑制氨基酸感应激酶1（master amino acid sensing kinase 1，GLK1），进一步抑制雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号分子。mTOR通过蛋白复合物mTORC1/mTORC2感受和整合外界生长因子、能量状态和营养水平等信息，在生物体生长发育和细胞自噬等过程中发挥重要作用。因而当mTOR信号受到抑制，可导致T细胞免疫效能下降，诱导T细胞自噬。

1.3.3Kyn结合并激活芳氢受体通路AhR是一种应对异型生物质的转录因子，与癌症以及炎癌转化密切相关。Opitz等发现Kyn是AhR的内源性配体，Kyn与AhR结合后，后者移位至细胞核，与芳烃核转位蛋白（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT）二聚化，诱导免疫抑制性IL-10的表达，导致未成熟的CD4+T细胞向免疫抑制的Treg转化。

除上述3种机制外，研究表明Kyn下游的活性代谢物，如犬尿胺、3-羟基犬尿氨酸、邻氨基苯甲酸、犬尿烯酸、喹啉酸等也具有免疫调节作用，在体内外均可诱导效应T细胞周期阻滞或凋亡。这些机制共同建立了支持肿瘤生长的免疫抑制性肿瘤微环境。

2IDO1抑制剂的研究现状

鉴于IDO1在肿瘤免疫逃逸中的关键作用，IDO1抑制剂的研究备受各个科研机构和制药公司的青睐，但迄今为止尚无IDO1抑制剂获得FDA批准上市。目前虽有多个IDO1抑制剂处于临床研究的不同阶段，但令人遗憾的是，进展最快的IDO1抑制剂epacadostat联合PD-1单抗pembrolizumab治疗转移性黑色素瘤的Ⅲ期临床试验（ECHO-301/Keynote-252）最终以失败告终。这次临床失败给开发IDO1抑制剂的公司带来了沉痛的打击，但这仅是众多临床试验中的一项，其失败并不能断定靶点IDO1不具有成药性，究竟是IDO1本身靶点的问题还是化合物的问题目前尚未可知。下面首先归纳总结导致此次Ⅲ期临床试验失败的可能的原因以及当前开发IDO1抑制剂所面临的关键问题；其次对现阶段进入临床研究的IDO1抑制剂及具有良好发展前景的尚处于临床前研究的化合物进行综述。

2.1ECHO-301/Keynote-252Ⅲ期临床试验失败原因分析及目前IDO1抑制剂研发中的挑战

Epacadostat是一种竞争性IDO1选择性抑制剂，其联合pembrolizumab治疗转移性黑色素瘤的Ⅲ期临床试验（ECHO-301/Keynote-252）在近期被中止。在为期14个月的中期随访中，epacadostat+pembrolizumab组与pembrolizumab+安慰剂组相比，未能明显延长无进展生存期（4.7月vs4.9月），二者对药物的反应率分别为34.2%和31.5%；治疗相关不良事件的发生率分别为79.3%和81.0%，大于3级治疗相关不良事件的发生率分别为21.8%和17.0%。最终得出结论，在对不可切除或转移性黑色素瘤的患者中，epacadostat联合pembrolizumab并未比单独使用pembrolizumab带来更大的临床益处，这种组合的安全性与以前报道的研究结果一致。这些阴性结果出乎意料，因为对多达14种不同实体瘤的临床前研究和早期临床试验都显示出了令人鼓舞的结果。对此失败，科学界提出了很多解释，主要包括Ⅲ期临床试验设计方案、IDO1的生物学机制、用药剂量、联合用药方式以及化合物本身等方面的问题。

在试验设计方案方面，此次Ⅲ期临床试验预选病人的生物指标考虑不充分：首先，IDO1抑制剂起效的关键机制是恢复效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，因此试验结果与患者肿瘤微环境中浸润性T细胞的基态水平密切相关，而此次Ⅲ期临床试验中并未考察患者的这一指标；其次，虽然PD-L1的表达为随机分层因子，但在早期研究以及此次Ⅲ期临床试验中仅以病人PD-L1的表达状态作为参考，而未考虑IDO1的表达情况，这导致所筛选的病人IDO1并未呈现高表达状态，对IDO1抑制剂并不敏感。值得注意的是，早期与后期阶段临床试验的人群之间也存在潜在的差异：早期阶段的试验在美国进行，而后期的研究主要在澳大利亚、欧洲、亚洲、南美洲等地区开展。可能由于种族差异而导致2次试验的结果不同。此外，在黑色素瘤治疗中，IDO1抑制剂并未表现出单独用药疗效，因而未事先进行规模较小的随机Ⅱ期试验，仅基于不受控制的Ⅰ/Ⅱ期试验的少量数据而启动大型Ⅲ期临床试验本身就具有较大的风险。

虽然目前IDO1在肿瘤发生发展中的作用及其机制研究取得了重要进展，但是IDO1在生理病理中的确切调控机制以及对肿瘤微环境等的影响尚需进一步的确证。因而，对IDO1生物学功能和机制理解的不够深入或许是造成临床失败的另一个重要原因。其一，另外2种Trp代谢酶IDO2和TDO在肿瘤免疫逃逸中可能也扮演着很重要的角色。比如，敲除小鼠IDO1后虽然延缓了4T1乳腺癌肺转移瘤的生长，但这种延缓是短暂的，随后肿瘤继续增长并伴随着Kyn浓度的增加。这表明选择性阻断IDO1的表达不足以持续缓解Trp减少和Kyn升高而引起的肿瘤免疫抑制效应。这可能是由于IDO1酶活性被抑制后，TDO和IDO2通路发挥潜在的代偿作用，造成Trp耗竭。其二，IDO1的非酶促作用可能在肿瘤的发生发展中具有重要作用，而目前开发的IDO1抑制剂主要靶向酶活性。其三，Kyn是肿瘤内Trp代谢后最稳定的产物，被证明是AhR的内源性配体。IDO1酶活性被抑制后肿瘤细胞可能还存在低水平的Kyn，而研究表明极低水平的Kyn足以激活AhR并且可以诱导AhR靶基因的表达，从而导致效应T细胞向Treg的转化。因此，选择性抑制IDO1酶活性是否足以解除Trp耗竭所造成的肿瘤免疫抑制目前还有待进一步确定。

实验表明，epacadostat在100mg（bid）给药剂量下外周血浆Kyn水平达到最低水平，继续增加剂量，Kyn水平不再继续降低，故Ⅲ期试验以Kyn在血清中的测量值为参考，选择了该剂量进行试验。众所周知，P-糖蛋白（p-glycoprotein，P-gp）是一种常见的表达于细胞膜的保护细胞免受外来侵害的“分子泵”。其在黑色素瘤等肿瘤细胞中均有表达，而epacadostat是P-gp的底物，因此药物会被当作外来异物而不能完全被肿瘤细胞吸收。在此情况下，血药浓度不能真实地反映瘤内药物浓度（即瘤内药物浓度低于血药浓度），血清的Kyn水平自然也不能真实地反映肿瘤内稳定状态下Kyn水平。综上，Ⅲ期试验中患者体内是否给予足够剂量的epacadostat存在不确定性。

Pembrolizumab与epacadostat联合用药可能未产生协同增效作用，原因可能是pembrolizumab单独治疗晚期黑色素瘤时已展现出良好的治疗效果，而这种效果可能足以覆盖epacadostat在联合用药中发挥的作用。不过也可能是由于IDO1抑制剂与抗PD-L1药物联合用药本身就不能产生良好的协同作用。鉴于IDO1广泛参与肿瘤免疫逃逸，IDO1抑制剂联用其他免疫检查点抑制剂值得尝试和期待。比如，CTLA-4是另一种调节T细胞活性的免疫检查点，目前CTLA-4抑制剂与IDO1抑制剂的联用处于Ⅰ/Ⅱ期临床研究阶段。另外，目前已有IDO1/PD-L1/CTLA-4多重免疫检查点抑制剂联用的报道。

值得一提的是，Ⅲ期临床试验中所用的IDO1抑制剂epacadostat本身可能存在药效活性不够强、药动学性质不佳等问题，因此活性优良、毒副作用少、具有良好药动学性质的新型IDO1抑制剂的研发迫在眉睫。然而，目前IDO1抑制剂的研发过程中还面临许多挑战。在体内药效学指标测试方面，临床前及临床试验中瘤内Kyn含量无法准确测定，L-Trp底物抑制情况以及抑制剂动力学测定等方面还需进一步优化。在化合物发现方面，尽管IDO1蛋白与其抑制剂复合物的晶体结构为基于结构的药物设计提供了基础，但由于IDO1蛋白结合口袋存在诱导契合现象，尤其是结合口袋B灵活多变，随着抑制剂形状和体积的改变，结合口袋自身的形状和体积会有较大的改变。这种诱导契合的存在，一方面因可以容纳多种不同形状和体积的结构而为结构多样的小分子抑制剂的设计带来机遇，同时由于无法通过计算准确预测所设计化合物的活性也为获得高活性IDO1小分子抑制剂带来极大的挑战。另外，IDO1蛋白的催化活性位点中存在血红素铁，它可以通过形成共价键与配体相互作用，IDO1抑制剂与血红素铁结合部分的电子性质对活性影响很大，但是这种影响在任何计算方法中都难以可靠地描述。

2.2IDO1抑制剂

目前报道的IDO1抑制剂主要是通过高通量筛选、天然产物结构改造及基于结构的合理药物设计等途径获得。表1总结了目前进入临床研究阶段的IDO1抑制剂。下面将按结构分类，重点讨论这些进入临床研究阶段的IDO1抑制剂以及近期报道的结构新颖且临床前活性数据较好的IDO1抑制剂，以期对IDO1抑制剂的后续研究与开发提供依据。

2.2.1色氨酸类似物Trp类似物的设计旨在开发IDO1的竞争性抑制剂，在Trp的N-1原子上引入甲基得到外消旋体化合物1（1-MT）。该化合物是较弱的IDO1抑制剂（IC50=34μmol·L-1），目前更多的是作为临床前研究IDO1通路的一种工具化合物。在HER-2阳性乳腺癌转基因模型中，1-MT单独用药对肿瘤生长几乎没有抑制作用，但可以增强多种化疗药物的疗效，尤其是致DNA损伤药物和紫杉醇，促进恶性肿瘤的消退。后续将1-MT进行手性拆分得到D-1MT（现称为indoximod，2）和L-1MT，D-1MT对IDO1酶几乎无抑制活性，但在动物模型中，与L-1MT相比，D-1MT表现出更强的抗肿瘤活性，目前D-1MT已成为具有潜在独特疗效的候选药物。后续的机制研究表明indoximod不是IDO1通路的直接抑制剂，对血浆Kyn的水平无影响，现在普遍认为其作用机制可能是调节Trp跨膜运输或模拟Trp调控IDO1下游信号通路。Indoximod可能作为一种高亲和力的Trp类似物，恢复T细胞因Trp减少而引起的mTORC1抑制，阻碍T细胞自噬，上调效应T细胞中共调节受体可诱导共刺激分子（inducible costimulatory molecule，ICOS）的水平，从而提高细胞免疫功能。Indoximod独特的作用机制为Trp代谢相关的免疫治疗药物的开发提供了新的思路。鉴于indoximod可以缓解Trp减少引起的mTORC1信号分子的抑制，可以推断其可以抑制任何Trp代谢酶高表达的肿瘤细胞的生长。Indoximod的Ⅰ期临床研究表明其耐受性良好，最大给药剂量为1200mg（bid）。在一项Ⅱ期试验中，indoximod与PD-1单抗pembrolizumab联用对某些晚期黑色素瘤患者的总体反应率可达52%，与FDA批准的PD-1单抗nivolumab/CTLA-4单抗ipilimumab联用的效果相当，且未出现高度自身免疫反应，因而其有望成为IDO1与其他药物联合用药发展中的一个重要里程碑。在另一项Ⅱ期临床试验中，indoximod联用DC疫苗Provenge使得转移性去势抵抗性前列腺癌病人的生存期相对于对照组延长了2倍之多。目前，indoximod联合pembrolizumab或nivolumab用于治疗转移性黑色素瘤的Ⅱ/Ⅲ期临床试验正在进行中。为改善indoximod的药动学性质，NewLink公司开发了其前药NLG-802，目前该化合物已进入Ⅰ期临床试验。

Crosignani等通过高通量筛选从178000个化合物的化合物库中得到了一些苗头化合物，其中最具优化潜力的是化合物3，尽管该化合物对人体IDO1酶仅显示出中等的抑制效果（IC50=3.0μmol·L-1），但其对人体TDO的IC50高达50μmol·L-1，显示其对IDO1具有较高的选择性；并且由于该化合物相对分子质量较低，配体效率（ligand efciency，LE）较高（0.47），因而该化合物与人体IDO1具有高效的相互作用，这种作用远高于其他含吲哚环的IDO1抑制剂。接着，Crosignani等以化合物3为先导化合物，对此类化合物进行了深入的结构优化和构效关系（structure-activiy relationship，SAR）研究：1）将琥珀酰亚胺结构移除1或2个羰基得到吡咯烷酮类、吡咯烷，或扩环成戊二酰亚胺（或其位置异构体）均会使活性大大降低；2）琥珀酰亚胺结构的N原子或脂肪碳原子上引入甲基，或将其结构中的CH2替换成NH或O，或在吲哚环和琥珀酰亚胺之间插入亚甲基均会大大降低其活性；3）将吲哚环替换成其他杂环时，活性均有所下降；4）在吲哚环的NH和C2、C4、C7位上分别引入取代基均使活性下降，而在吲哚环C5和C6位上引入某些取代基可以提高活性，如在C5位上引入氟、氯、溴时活性增加（IC50分别为0.15、0.83和0.37μmol·L-1），而引入甲基、三氟甲氧基、三氟甲基时活性完全丧失，在C6位上引入溴活性提高（IC50=0.42μmol·L-1），但在C5和C6位分别引入氟和溴时活性却不如仅在C5位引入氟得到的化合物4（PF-06840003）活性好（IC50=0.15μmol·L-1）。该化合物作为非竞争性IDO1抑制剂由iTeosSA公司授权给辉瑞公司。进一步对化合物4进行手性拆分，发现主要是R构型的化合物5发挥作用（IDO1：IC50=0.12μmol·L-1），但在HeLa细胞体系中的酶抑制活性，2种构型之间的活性差异仅为13倍，这可能是由于与羰基相邻的手性碳的快速差向异构化作用。因此，鉴于2种构型在细胞水平上活性差异不大，后续研究用的药物采用外消旋体。

为了进一步研究化合物4与IDO1的结合模式，Crosignani等进一步解析了化合物4与IDO1的共晶结构（见图3）。由该图可见，与其他IDO1抑制剂不同的是，该化合物不与血红蛋白的铁离子发生相互作用；Tyr126、Phe163、Phe164与吲哚环产生π-π相互作用，Leu234、Val130、Cys129残基也可与吲哚环发生疏水相互作用，这些残基共同组成了结合口袋A，围绕在吲哚环周围；吲哚环上的NH与Ser167形成氢键。琥珀酰亚胺环与亚铁血红素蛋白平面平行，其NH与血红素蛋白上的7-羧酸形成氢键；2个羰基分别与Ala264和Thr379的氨基形成氢键。IDO1酶的活性位点与化合物4堆积紧密，因而在吲哚环上引入较大基团，或者改造琥珀酰亚胺结构均有可能造成活性的降低。

PF-06840003在体外能够逆转IDO1高表达导致的T细胞效能下降，并在体内将肿瘤内Kyn水平降低80%以上。该化合物具有较好的药动学性质，半衰期（16~19h）较长，可允许每日单剂量给药。此外，该化合物可以透过血脑屏障，因而可用于治疗脑内转移性肿瘤。目前，其用于治疗恶性胶质瘤已进入Ⅰ期临床研究（NCT02764151）。

此外，文献和专利中还报道了Trp类似物IDO1抑制剂，如在吲哚环上引入一些可以伸入口袋B的取代基得到化合物6（IC50=13.1μmol·L-1）、7（IC50=46μmol·L-1）、8（IC50=0.19μmol·L-1）、9（IC50=7μmol·L-1）和10（Ki=11.5μmol·L-1）；将吲哚环替换成其他骨架得到一系列具有新颖结构的化合物，如化合物11~13（IC50分别为5.3、6.1和2.8μmol·L-1），当吲哚环被替换成吡啶并咪唑结构时得到化合物14（IC50<1μmol·L-1）和15（IC50=11nmol·L-1），或以异唑代替吲哚环得到化合物16（IC50<1μmol·L-1）。

2.2.2芳基咪唑类及其衍生物4-苯基咪唑（4-PI）（17）是1989年发现的一种较弱的IDO1非竞争性抑制剂（IC50=48μmol·L-1）。为进一步研究4-PI与IDO1的结合模式，Sugimoto等于2006年报道了4-PI与IDO1的共晶结构；由图4可见，4-PI占据了由Phe163、Cys129、Ser167、Gly261和Gly262所形成的疏水结合口袋A，咪唑环中的氮原子则与血红素中铁离子形成配位键，活性位点入口以及结合口袋B被结晶缓冲分子N-环己基-2-氨基乙磺酸（CHES）所占据，其位置与4-PI非常接近，Gly261和Gly262与CHES分子中的乙基磺酸链发生相互作用，而氨基与血红素7-丙酸形成离子对。

基于4-PI与IDO1的共晶结构，Kumar等对4-PI骨架展开了深入的结构修饰（见图5），主要包括：1）调节活性位点区域入口处的相互作用；2）调节内部活性位点的作用，特别是与Cys129和Ser167的相互作用；3）调节与血红素铁离子的结合作用。调节活性位点入口处的相互作用，主要是在C1、N1和N3位进行结构修饰。为模拟CHES分子中氨基部分与血红素铁离子的相互作用，该研究团队在N1位引入取代基，使得活性完全丧失，而在N3位以苄基取代的化合物18意外有了与4-PI相当的活性（IC50=32μmol·L-1），这可能是该化合物的空间构型能较好占据CHES缓冲分子所处的活性位点入口所致；然后，他们对4-PI结构中占据结合口袋A的苯环进行了结构改造，以巯基间位和邻位取代的化合物19和20活性有较大的提高（IC50均为7.6μmol·L-1），而在苯环的邻位以羟基取代所得的化合物21活性比4-PI增加了10倍（IC50=4.8μmol·L-1），在化合物21的羟基上再引入一个较大的基团得到了IC50小于1μmol·L-1的化合物22；最后，为了进一步增加化合物与血红素铁离子的结合力，他们以不同的芳香杂环如吡啶、噻唑、吡唑和呋喃替代咪唑环，得到的大部分化合物活性均不如4-PI，这说明噻唑、吡唑和呋喃与血红素铁离子的结合力均不如咪唑。这也不足为奇，咪唑环是一种被广泛认可的天然铁离子配体，在铁离子结合强度和蛋白形状互补性方面都是最佳的，例如含咪唑环结构的组氨酸。但随后的研究发现三氮唑类结构也具有较好的活性，如化合物23（IC50=0.33μmol·L-1）。Tojo等基于合理药物设计，将咪唑环替换成三氮唑并噻唑结构得到化合物24（Amg-1，IC50=3μmol·L-1），并解析了该化合物与IDO1复合物的晶体结构，其显示了新颖的结合模式。如图6A所示，化合物24不仅可与血红素铁离子及结合口袋A发生相互作用，也能与另外一个由关键氨基酸残基Phe226和Arg231形成的结合口袋B相互作用。将咪唑环替换成咪唑并噻唑得到化合物25，活性略有提高（IC50=1.9μmol·L-1）。通过分析化合物25与IDO1的共晶结构（见图6B）得知，受氨基酸残基Phe226的影响，化合物25侧链亚甲基大幅度弯曲，使其侧链上的苯环与Phe226发生π-π相互作用，无法与Arg231残基产生静电相互作用。而当引入刚性连接臂以限制其侧链构象，使得苯环上的氰基足以到达Arg231残基周围，得到能够同时与Phe226和Arg231相互作用的化合物26，活性显著提高（IC50=77nmol·L-1）。这进一步说明结合口袋B以及氨基酸残基Phe226和Arg231对于IDO1抑制剂活性的发挥具有重要作用。

将4-PI的3位与2'位通过稠环连接形成三环骨架结构，并引入侧链得到化合物NLG919（navoximod，27）及其类似物28，活性大大提高（IC50分别为13和38nmol·L-1）。与其他芳基咪唑类IDO1抑制剂相同，NLG919是一种非竞争性抑制剂，且具有较好的口服生物利用度、药动学性质和较小的毒副作用。小鼠经口给药时，其血浆Kyn水平降低约50%，并减轻IDO1诱导的T细胞抑制。在临床前模型中，化合物27极大地增强了B16黑色素瘤对疫苗的免疫应答，在疫苗接种后4d内将肿瘤大小减少约95%。另外，该化合物能够提高抗PD-1药物对EMT6乳腺癌的疗效，增加CD8+T细胞/Treg比率，提高血浆IFN-γ水平，并活化瘤内巨噬细胞和DC。ⅠA期临床试验（NCT02048709）数据显示，22位患者平均给药3个周期，化合物NLG919展现出了较好的安全性、药动学和药效学性质。目前，该化合物联合抗PD-L1单抗atezolizumab用于治疗实体瘤的ⅠB期临床试验（NCT02471846）正在开展中。

2016年，Peng等报道了化合物28与IDO1复合物的晶体结构（见图7）。此共晶结构与IDO1/4-PI共晶结构相比具有较大差异。在IDO1/4-PI复合物晶体结构中，4-PI仅占据结合口袋A，而且血红素的7-丙酸侧链远离配位点，并不与4-PI发生相互作用。因而4-PI更像是具有较弱IDO1抑制活性的片段样化合物。而在IDO1/化合物28共晶结构中，咪唑并异吲哚结构与氨基酸残基Tyr126、Cys129、Val130、Phe163、Phe164、Gly262和Ala264形成的疏水性口袋A发生疏水相互作用；1-环己基乙醇结构则伸入另一个由氨基酸残基Phe226、Ile354和Leu384形成的结合口袋B，并且与Arg231靠近发生静电相互作用；咪唑的N1与血红素铁离子形成配位键。化合物28也可与IDO1蛋白形成广泛的氢键网，如血红蛋白7-丙酸分别与化合物28的羟基以及Ala264的NH形成分子间氢键；异吲哚上的氮原子与化合物28分子上的羟基形成分子内氢键。与4-PI相比，化合物28能够以更大的区域与IDO1蛋白相结合，并在空间上与IDO1形成广泛的氢键网，这可能是化合物28比4-PI具有更好抑制活性的原因。

除了上述化合物外，目前专利中报道的芳基咪唑类IDO1抑制剂主要是针对NLG919深入口袋B的侧链的修饰以及对咪唑并异吲哚结构的修饰所得的化合物（29~40）。其中，对侧链的修饰，如将NLG919的环己基醇结构替换为酰化的哌啶环或酰化的氮杂环丁烷得到化合物29和30，二者IC50均小于1μmol·L-1；或在环己基上增加C桥也可以得到IC50小于100nmol·L-1的化合物31和32；连接环己醇与咪唑并异吲哚的连接臂上的羟基可以被移除，或以1或2个氟取代，得到化合物33~35（IC50<100nmol·L-1）；也可以将整个侧链替换得到化合物36（IC50=5.1nmol·L-1）。对咪唑并异吲哚结构的修饰，以吡啶环代替咪唑并异吲哚的苯环，得到化合物37和38（IC50均小于100nmol·L-1），以噻唑环取代苯环得到化合物39（具体构型未公布）（IC50=7.2nmol·L-1）。另外，在咪唑并异吲哚环中间的五元环上插入一些基团而扩环，如增加CH2基团得到化合物40，也能维持较好的抑制活性（IC50=49nmol·L-1）。

2.2.3N-羟基脒类INCB24360（epacadostat，41）是由Incyte公司研发的羟基脒类IDO1选择性抑制剂。其发现过程如图8所示，通过高通量筛选得到了具有微摩尔活性的苗头化合物42，其具有低相对分子质量（<250）、良好配体效率（LE=0.49）、微摩尔细胞水平IDO1抑制活性（IC50=1μmol·L-1）以及良好的人结直肠癌细胞Caco-2渗透性（3.9×10-5cm·s-1）等特点，为后续研究提供了良好的起点。早期的SAR研究表明：以苯基取代苄基后所得到的化合物对IDO1抑制效果更好；在苯环的间位增加一些取代基，如间位卤素和较小烷基时，化合物的细胞活性可增强（间位取代的活性由大到小依次为：溴，氯；甲基，乙基；异丙基，氟；甲氧基，叔丁基）。在邻位取代的基础上，对位引入氟原子得到化合物43，其人体外血浆清除率有所增加，但细胞活性并不损失。该化合物具有较好的血浆清除率，可能是其相对分子质量较低且含有2个分子内氢键的低能构象所致。将羟基脒结构上的羟基替换成甲氧基，或将羟胺的氮原子替换成硫或氧原子均会导致活性的降低或消失。化合物43在IDO1生化和细胞水平测试中表现出纳摩尔级抑制活性（IC50=67nmol·L-1），并且对TDO具有优异的选择性，但口服生物利用度差。羟基脒的羟基在体内发生葡萄糖醛酸化可能是羟基脒类化合物的主要代谢途径，是造成此类化合物口服生物利用度差的主要原因。进一步的研究表明，呋咱环为维持活性所必需的基团。将呋咱环的侧链位置增加一些取代基，通过空间或电子碰撞破坏化合物与近端葡糖醛酸糖苷酶活性位点的结合，可减少羟基脒发生葡萄糖醛酸化。当侧链引入单取代烷基（如甲基、苄基等）时，IDO1抑制活性保留或稍有下降，但体外血浆清除率并未下降，这可能是由于这些化合物的疏水性而导致的蛋白结合率高所致。为了减少蛋白质结合并恢复细胞活性，Incyte公司将呋咱环侧链位置的氨基乙基取代基中加入多种极性基团形成一系列极性侧链，以降低葡萄糖醛酸化的同时保持IDO1抑制活性，经过一系列SAR研究后最终发现了一种高效的选择性IDO1抑制剂41（IC50=72nmol·L-1）。

Epacadostat作为人体IDO1的Trp竞争性抑制剂，对IDO2和TDO2具有100余倍的选择性。在具有DC或肿瘤细胞的人类同种异体淋巴细胞的共培养物中，epacadostat促进效应T细胞和NK细胞的生长，减少了T细胞向Treg的转化，并增加了CD86+DC的数量。在黑色素瘤的啮齿类动物模型中，epacadostat能够有效抑制肿瘤的生长，并且在新药临床研究（investigational new drug，IND）毒理学数据展现出良好的耐受性。另外，在B16黑色素瘤模型中，epacadostat显著提高IL-2水平，促进CD8+T细胞增殖，增强CTLA4或PD-L1单抗的抗肿瘤作用。在前期的临床试验中，epacadostat也显示了良好的疗效，但如前所述，epacadostat+pembrolizumab联用治疗转移性黑色素瘤的Ⅲ期临床试验（ECHO-301/Keynote-252）最终以失败告终。目前，epacadostat与IDO1的共晶结构已被报道（见图9）。与其他IDO1抑制剂不同，epacadostat通过羟基脒上的氧原子与血红素的铁离子发生配位（其他IDO1抑制剂一般是通过氮原子），Ala264的NH与肟上的氧原子所形成的氢键可以稳定此配位作用。该化合物内存在2个分子内氢键，包括肟上的氧与苯环上的NH以及肟上的氮与呋咱环上的NH形成的分子内氢键，这种分子内氢键使得epacadostat的构型保持稳定。苯环占据结合口袋A，与周围氨基酸残基Phe163、Leu234、Phe164、Val130、Tyr126和Ser167发生疏水作用，苯环上的氟原子靠近氨基酸残基Cys129而发生氟-硫键的相互作用以稳固蛋白与抑制剂的相互作用。呋咱环及极性侧链伸入口袋B，与氨基酸残基Phe163、Leu234和Phe226发生疏水相互作用，磺酰胺基团的氧原子与Arg231发生氢键相互作用。

目前，基于epacadostat的结构改造大多是对伸入口袋B的呋咱环和氨基侧链进行修饰。如保留呋咱环结构，改变侧链得到化合物44~48，其IC50分别为18、11、33、26和13nmol·L-1；以其他芳环代替呋咱环得到化合物49（IC50=111nmol·L-1）和50（IC50=247nmol·L-1）；以环烷烃或杂环烷烃取代呋咱环并引入羰基得到化合物51（IC50=2nmol·L-1）和52（IC50=4nmol·L-1）；以环烷基取代的烷基链代替呋咱环得到IC50小于1μmol·L-1的化合物53；以硝基取代的苯并呋咱环结构代替呋咱环得到化合物54（IC50=59nmol·L-1）。

2.2.4喹啉类及其他类化合物BMS-986205（55）是BMS公司从Flexus公司收购的高效、可口服的IDO1抑制剂。它是目前进入临床研究的唯一一种自杀型抑制剂（不可逆抑制剂）。在临床前试验中，BMS-986205对HEK293细胞及HeLa细胞的IDO1酶抑制活性（IC50）分别达到1.1和1.7nmol·L-1。在BMS-986205存在下，与人癌细胞共培养的T细胞能够大幅增殖。在同系和异种移植小鼠模型中，该化合物显示出优于navoximod（27）和epacadostat（41）的药效学性质。评估对比治疗前和治疗中肿瘤组织样本，BMS-986205使肿瘤内Kyn水平降低90%。然而受ECHO-301/Keynote-252的影响，BMS-986205与PD-1单抗nivolumab联用的Ⅲ期临床试验被终止。Flexus公司基于化合物55得到一系列其他喹啉类化合物（56~62）。构效关系表明：环己烷很重要，将其替换成环戊烷、环丁烷均会导致活性的降低，但以4-羟基哌啶或4-羟基环己烷替代环己烷得到的化合物56和57活性保持（IC50均小于50nmol·L-1）；环己基与苯环间的酰胺键替换成反转后的酰胺键、磺酰胺键或脲基，活性保持，如化合物58~60（IC50均小于50nmol·L-1）；喹啉环替换成单芳环得到的化合物61活性保持（IC50<100nmol·L-1）。

苯环上以氰基取代得到化合物BMS-116（62，IC50<100nmol·L-1），该化合物与IDO1形成的共晶结构在近期被报道（见图10A）。与经典的IDO1抑制剂不同，化合物62是通过与不含亚铁血红素的IDO1结合而发挥作用。其中氰基取代的苯环占据由Leu234、Gly262、Ser263、Ala264、Phe163、Phe164、Val130、Cys129和Tyr126等氨基酸残基形成的结合口袋A，与Tyr126残基发生π-π相互作用。酰胺基团上的NH与周围的Ser167发生氢键相互作用。环己基起到连接链的作用，使喹啉环正好处于由Phe270、Phe214、His346和Arg343形成的疏水性口袋中，其中喹啉环可与Phe270发生π-π相互作用；喹啉环上的N可与Arg343形成氢键。值得一提的是，这种疏水口袋与以往报道的口袋A和口袋B不同，是一种新发现的抑制剂结合位点，与Lewis-Ballester等在2017年报道的IDO1-CNTrp/3-吲哚乙醇（63，3-indole ethanol，IDE）复合物晶体结构（见图10B）中的第2个色氨酸结合位点（Si）相对应。早期研究表明：当Trp大量存在时，Trp会占据Si位点，改变酶的构型，使IDO1酶出现底物抑制现象，导致酶的催化反应速率降低。IDE作为IDO1酶的效应分子通过占据Si位点来提高IDO1酶的活性。从图10B中可以看出，IDE分子紧邻血红蛋白分子，吲哚环与血红蛋白平行，IDE分子上的羟基与血红蛋白的6-丙酸形成氢键。吲哚环进入由Phe270、Val170、Ala174、Phe273、Ala210、Leu207、Leu339、Leu342和Phe244组成的疏水性口袋。这种独特的结合模式表明除了经典的活性位点（口袋A与口袋B）对底物活化至关重要，另一结合位点Si也能在酶与底物的结合中发挥重要作用。Si位点为高浓度Trp条件下出现的底物抑制现象提供了合理解释，也为变构抑制剂的开发提供了新的靶点。

Pham等近期报道了BMS-986205与IDO1结合的3种共晶结构，每种共晶结构均含有2个不同的单体，从而确定了该抑制剂与蛋白结合的动力学途径。BMS-986205首先在活性位点附近的溶剂表面裂缝中以延伸的构象与蛋白结合，此时抑制剂构象如图11A中构象1（conformation1，C1）。紧接着，结合部位活性位点部分打开，触发血红素释放，从而暴露出新的结合口袋。然后，抑制剂经历大范围运动到达这个新的结合口袋，并以高能量扭曲构象与蛋白结合（C2）。C2构象并不稳定，抑制剂通过构象的转变使抑制剂松弛至弯曲的构象（C3），达到能量最小的稳定状态。这种抑制剂的稳定构型的晶体结构与BMS-116的晶体结构类似，此构型的抑制剂与不含血红蛋白的IDO1酶相互作用，且只占据活性位点的口袋A及Si位点。氯取代的苯环占据结合口袋A，环己基使喹啉环导向Si位点。在Si位点，Phe270与喹啉环发生π-π相互作用，喹啉环的N原子与Arg343产生氢键相互作用；酰胺键上的N和O分别与Ser167和His346产生氢键相互作用。BMS-986205进入最终结合位点的动力学路径突出表现了IDO1蛋白质超强的可塑性及该抑制剂独特的灵活性。由于目前对蛋白的结构信息的了解有限，药物的研发受到阻碍。因而研究人员需要更深入地了解更多的抑制剂的特定晶体结构的不同特征，了解靶标活性位点内的配体-IDO1之间的相互作用，这才有助于设计新型的强效和选择性IDO1抑制剂。

2.2.5其他结构类型的IDO1抑制剂除上述几类主要的抑制剂外，目前还有许多其他结构新颖的IDO1抑制剂被报道。具有苯磺酰肼结构的化合物64（IC50=35.8nmol·L-1），是一种高效的可口服的选择性IDO1抑制剂，在小鼠CT26同系模型中，经口给予400mg·kg-1后显示出59%的口服生物利用度和73%的抑瘤率。具有嘧啶酮结构的化合物65（IC50=7.5μmol·L-1），由于其良好的细胞穿透性以及低毒性，使得此类骨架的化合物值得进一步被研究。通过高通量虚拟筛选方法以及IDO1体外生物活性测试，获得了结构新颖且配体结合效率适中的化合物66~68（IC50分别为7.5、7.5和0.84μmol·L-1），基于这些化合物进行结构修饰有望获得新型IDO1抑制剂。默沙东（MerckSharp&Dohme）公司近期也报道了一类高效的IDO1抑制剂，如化合物69（IC50=0.7nmol·L-1）。百时美施贵宝（BMS）公司报道的一系列含苯基脲结构的化合物如70均具有较好的细胞活性（IC50=3nmol·L-1）。通过拼合手段得到的具有芳基取代的丙烯酸结构的化合物71，其IC50为2.5μmol·L-1。芳基噻唑啉结构中以化合物72活性最佳（IC50=2.5μmol·L-1），虽然对其苯环上的结构修饰空间有限，但是此系列也存在改造结合口袋B的可能性。近期，一些醌类化合物如73被看作是高效且低毒的IDO1抑制剂（IC50=23nmol·L-1），但醌类化合物的作用机制可能仍需进一步探讨。

3结语与展望

近年来，肿瘤免疫疗法已经取得了突破性进展，为人类战胜恶性肿瘤带来了希望的曙光。IDO1在肿瘤细胞以及多种免疫细胞中高表达，催化Trp的Kyn代谢途径中的关键步骤，造成肿瘤微环境中Trp耗竭，通过调控GCN2、mTOR和AhR等信号通路影响肿瘤微环境中效应T细胞和免疫抑制性Treg的增殖与活性，造成免疫抑制性的肿瘤微环境，使得肿瘤细胞逃脱机体免疫系统的攻击。因此，IDO1成为小分子免疫检查点抑制剂的潜在有效靶点，备受各大制药公司和科研机构的青睐。IDO1与其抑制剂共晶结构不断被报道，为基于结构的合理药物设计提供了结构基础，特别是最近发现的Si位点为IDO1变构抑制剂的开发与研究奠定了基础。目前，已报道了多种不同结构类型的IDO1小分子抑制剂，并且有多个抑制剂进入临床研究阶段。但是令人遗憾的是，最近报道的临床试验结果并不理想。特别是，进展最快的IDO1抑制剂epacadostat联合PD-1单抗pembrolizumab治疗转移性黑色素瘤的Ⅲ期临床试验（ECHO-301/Keynote-252）以失败告终。这次临床试验的失败并不代表IDO1靶点不具有成药性，但说明IDO1抑制剂的研发的确还存在很多亟待解决的问题。比如，在生物学机制方面，肿瘤细胞如何诱导自身IDO1高表达、IDO1对肿瘤微环境的影响及其确切的作用机制、Trp代谢通路及其下游代谢产物在肿瘤免疫逃逸中发挥的作用、IDO1与它的2种同工酶IDO2和TDO在肿瘤免疫逃逸中关联与区别等关键问题目前尚不完全清楚。在抑制剂的设计方面，IDO1蛋白的结合口袋B灵活多变，为设计结构多样的IDO1抑制剂带来机遇，但也为高活性IDO1抑制剂的设计带来挑战。在抑制剂活性测试方面，Kyn的瘤内含量、L-Trp底物抑制情况以及抑制剂动力学测定等方面还需进一步优化。尽管IDO1与PD-L1单抗联用的临床试验失败，但IDO1与其他免疫检查点抑制剂联用于其他肿瘤的治疗仍值得期待，并且这可能是IDO1抑制剂未来的主要研究方向之一。随着研究方法和技术的成熟，以及IDO1通路在肿瘤免疫逃逸中的作用机制被阐明，更多具有新结构类型、新作用模式的高效IDO1抑制剂将被设计出来，从而为肿瘤免疫治疗小分子药物的开发带来新的突破。