点评 | 叶丽林（陆军军医大学）、伍拓琦（科罗拉多大学）
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T细胞耗竭(T cell exhaustian)是广泛存在于慢性感染和癌症环境中的一种现象。在慢性系统性炎症疾病中，耗竭性T细胞(Tex cells)是控制抗原的主要参与者之一，其高表达免疫抑制分子诸如PD-1, Tim-3 和Lag-3。治疗药物如Anti-PD-1 blockade Nivolumab (Opdivo，中文名欧狄沃)或Pembrolizumab (Keytruda, 中文名可瑞达) 靶向作用于这些免疫抑制分子，已经被证明在多个癌种中拥有较好的免疫响应。然而，只有少部分病人可以达到长期的功能性治愈或者病情控制，而多数病人在短期免疫响应后，没有得到长期的肿瘤控制。宾夕法尼亚大学的E. John Wherry组在2016年证实，在抗原无法被完全清除的慢性感染环境中，耗竭性T细胞的效应细胞状态虽然可以被抗PD-1通路疗法激活，但是其T细胞命运却因为表观遗传上的不可逆转性而无法被更改【1】。这种耗竭性T细胞在表观遗传上的稳定性，在早期感染阶段就已经被耗竭性T细胞特异的核心转录因子Tox所部分锁定【2-5】（详见BioArt报道：专家点评| 3篇Nature1篇Nat Immuno揭示调控耗竭CD8+T细胞的关键因子）。2016年，埃默里大学的Rafi Ahmed组和陆军军医大学的叶丽林组同时揭示，耗竭性T细胞在慢性感染建立后，具有祖细胞(Progenitor)和终末分化细胞(Terminal)两个主要亚群。前体细胞亚群高表达趋化受体CXCR5和转录因子TCF-1，而终末端耗竭性T细胞则高表达免疫抑制受体Tim-3【6,7】。然而，由于耗竭性T细胞早期的细胞命运已经被部分锁定，因此TCF-1阳性的耗竭性T细胞祖细胞如何分化而来并不得而知。同时，在慢性感染早期，研究人员也并未发现大量高表达PD-1的终末端耗竭性T细胞，什么细胞起到了主要控制当期感染的抗原响应作用，也亟待详细阐述。2019年10月9日，E. John Wherry组(共一为UPenn免疫系在读博士生陈则宇和JHU生物统计系在读博士生季志成)在Immunity 杂志上发表了文章TCF-1-Centered Transcriptional Network Drives an Effector versus Exhausted CD8 T Cell-Fate Decision，揭示在小鼠模型中慢性感染和肿瘤发生早期，存在着耗竭性T细胞前体(Tex precursors)和类效应性T细胞(Effector-like T cells, Teff-like)的二元分化机制的相关报道。
研究者们首先使用了单细胞测序技术，使用模拟分化时间预测(pseudotime prediction)的方案，发现在慢性感染早期，可能存在着两个细胞分化路径。其中一条高表达以TCF-1(被Tcf7编码)及其相关下游基因族，而另一条路径则高表达Granzymes以及以KLRG1基因族为代表的类效应T细胞基因(图 1). 此分化路径与之前【5】报道的通过单细胞测序预测的细胞命运结果类似。 图1. 模拟时间分化预测揭示“耗竭性T细胞前体”和“类效应T细胞”的二元分化路径。
随后，研究者们利用流式细胞分析技术，在蛋白组层面上详细的鉴定在感染早期KLRG1+CD39+/Tim-3+的亚群确实具有较高的细胞因子和杀伤性分子分泌特征，同时也具有更高的活跃细胞周期的标记物Ki67。另一方面，TCF-1+Ly108+PD-1+的耗竭性T细胞前体亚群的细胞分泌状态和周期状态相对静息，确认了在慢性感染早期确实存在类效应细胞的亚群。那么细胞周期较为活跃的类效应细胞亚群为何并没有在慢性感染后期大量出现呢？研究者们进一步发现，相比于耗竭性T细胞前体，类效应细胞亚群具有更高的Bim:Bcl-2比例和更加不稳定的核结构状态。进一步的流式分选-谱系追踪实验表明，KLRG1+CD39+类效应细胞亚群很难在慢性感染持续过程中存活，而TCF-1+PD-1+的耗竭性T细胞前体可以较好存活并部分分化为TCF-1-PD-1++的终末分化耗竭性T细胞。然而，研究者们并没有观察到在抗原维持高位的时间段里，耗竭性T细胞前体可以分化为类效应T细胞的证据，进一步证明了类效应T细胞和耗竭性T细胞在持续的慢性感染中是两条不同的细胞命运(图 2).图2. 谱系追踪实验证明耗竭性T细胞亚群比类效应T细胞亚群有更好的长期生存。
这个二元分化机制的分子机理又是什么呢？研究人员将目光再次锁定到了转录因子TCF-1上。在CD8 T 细胞上特异性敲除TCF-1，会导致在早期的KLRG1+CD39+类效应T细胞亚群的增多，但是在长期慢性感染中，因为耗竭性T细胞前体的缺失，总体的抗原特异性T细胞数量会发生锐减。进一步的，研究人员发现，过表达TCF-1会增加耗竭性T细胞前体的比例，从而使得整个抗原特异性T细胞库在长期维持一个较稳定的水平。研究人员还发现，敲除PD-1后，虽然T细胞总体会发生扩增，但是其中TCF-1+的前体细胞比例会下降，揭示了PD-1可能在感染早期起到了对于抗原特异性T细胞的保护作用，防止其发生过度激活而引发的T细胞死亡。之后，研究人员将目光锁定到了阐明TCF-1作为核心转录因子，如何系统性的控制整个细胞命运决定的机制。因为转录因子在单细胞测序中通常存在检测量偏低的问题，研究人员首先建立了基于转录因子在pseudotime analysis上的关联性来预测基因之间关系的方法(StateTransition Inference Predictor, STIP). 该方案减小了转录因子关联预测因为低检测造成的假阴性结果，并且与ATAC-Seq进行融合网络分析后, 重构了Tcf7的可能下游转录因子调控网(图3)。研究者选定了两个主要的TCF-1下游转录因子进行验证实验。首先，研究者们证明了TCF-1是介导Tbox转录因子T-bet和Eomes之间转换的核心因子。TCF-1直接在转录上增加了Eomes的表达，而Eomes本身是耗竭性T细胞生存的必要分子。其次，研究者们证明了TCF-1可以提高c-Myb的表达量。与之前的研究相同的是，c-Myb介导了Bcl-2的高表达，从而增强了耗竭性T细胞前体的存活【8】。该项研究首次从分子机制层面上揭示了在慢性感染环境中，效应和耗竭性T细胞的二元分化路径。同时，该研究系统而精确的解答了TCF-1作为耗竭性T细胞前体细胞/祖细胞中的关键转录因子，控制T细胞分化与存活的机制。这些发现对于当下的CART治疗方案中，是否应该使用更高的促效应T细胞的细胞因子预处理，以及对是否需要在CART设计中引入促细胞活化/生存的因子提供了借鉴。同时，对于判断免疫检查点抑制剂阻断剂造成的效应T细胞效果的持续性，以及是否应该进一步跟进免疫检查点阻断剂治疗剂量，给予了相应的参考价值。CD8 T 细胞功能性耗竭是机体免疫系统不能清除慢性病毒感染（HBV, HCV,HIV等）及肿瘤的主要原因。耗竭的CD8 T细胞表达PD-1，TIM3，LAG3， TIGIT等免疫检查点抑制性受体。以PD-1抗体为代表的免疫检查点阻断疗法在肿瘤临床治疗领域取得重大成功，其作用机理主要在于阻断免疫检查点受体介导的抑制性信号通路，可以在一定程度上逆转CD8 T细胞耗竭，从而可以部分恢复其抗肿瘤的免疫功能。但是，不是所有的耗竭性CD8 T细胞都可以功能性地响应PD-1治疗。我们和 Rafi Ahmed团队同时发现，耗竭的CD8 T细胞是异质性的，存在耗竭性祖细胞（Progenitor， CXCR5+TCF-1+Tim3-）,及耗竭的终末分化细胞（Terminally differentiated, CXCR5-TCF-1-Tim3+），并且只有precursor细胞可以功能性的响应PD-1免疫检查点阻断【6,7】。这些研究进一步地揭示了耗竭的CD8 T细胞响应PD-1免疫检查点阻断的分子及细胞机制。但是，这两群细胞在免疫应答的早期如何形成、如何调控及如何维持并不清楚，是领域内亟需回答的科学问题。最新在线的免疫学顶级期刊Immunity, 来自宾夕法尼亚大学医学院免疫学系John Wherry研究组的陈则宇等利用小鼠的LCMV-CL13慢性病毒感染模型，采用单细胞测序及分析技术，发现在感染后的第八天，病毒特异性的CD8 T细胞呈现二元分化途径，即KLRG1+效应性T细胞及PD-1+Ly108+耗竭性前体（Precursors）T细胞，而耗竭性前体T细胞则会进一步分化为终末分化的PD-1+CD39+的耗竭性T细胞。在此二元分化命运的抉择中，转录因子TCF-1起着关键作用，其促进耗竭性前体细胞的分化，而抑制效应性T细胞的分化。随着耗竭程度的加深，KLRG1效应性T细胞几乎凋亡殆尽，而耗竭性T细胞，包括前体T细胞与终末分化细胞则可维持下来。TCF-1可以维持耗竭性T细胞pool，在于其可上调转录因子EOMES及Myb, 特别是后者可以抵抗细胞凋亡；而TCF-1自身的表达则依赖于PD-1介导的抑制性信号通路，因为过强的TCR信号刺激通常会导致TCF-1表达下调。这些研究结果加深了我们对CD8 T细胞耗竭动态过程的理解，强调了TCF-1的表达对于PD-1免疫检查点治疗效应的关键作用，并且提示，增强TCF-1的表达可能会提升PD-1免疫检查点治疗的效力。慢性感染和肿瘤病人中的CD8 T淋巴细胞发生功能耗竭，因而无法有效清除感染细胞或者肿瘤细胞。导致CD8 T细胞耗竭的因素众多。其中包括了PD-1等受体介导的免疫检验点信号，微环境中的免疫抑制性因子，以及持续T细胞受体信号刺激。过去二十年包括免疫检验点阻断（immune checkpointblockade）和过继性细胞免疫治疗(adoptive cell therapy)在内的免疫疗法在治疗癌症上取得了突破性的成功。然而并非所有病人都对免疫治疗有临床反应。因而在细胞分化和分子通路层面上理解T细胞对免疫治疗的反应对未来进一步提升免疫治疗的疗效有至关重要的意义。我们以及其他团队发现耗竭T细胞群包括了祖细胞(progenitor-like)及终末耗竭细胞(terminally exhausted)两个亚群【6,7,9-11】。其中祖细胞亚群是维持CD8 T细胞介导的长期免疫反应以及对免疫检验点阻断的免疫反应起关键作用的细胞群。这个细胞群的分化被TCF-1在内的转录因子以及诸如type I interferon等细胞因子调节。我们团队今年用单细胞RNA测序揭示转录因子TOX介导的信号调控祖细胞与记忆前体细胞(memory precursor)在免疫应答早期的分异【5】。然而，耗竭细胞的另外一个亚群终末耗竭细胞的分化调控以及其与效应细胞(effector cells)关系仍不清楚。宾夕法尼亚大学医学院免疫系John Wherry实验室的陈则宇等使用单细胞RNA测序比较了病毒特异性CD8 T细胞在LCMV慢性与急性感染第八天的单细胞转录组。这篇最新在Immunity上线的文章揭示慢性病毒感染早期病毒特异性细胞除了祖细胞以及终末耗竭细胞之外还包括第三个KLRG1+亚群。此亚群在分化与功能上与急性感染中的终末效应细胞类似并在慢行感染两周内消失，故名为类效应细胞(effector-like T cells)。类效应细胞分化被转录因子TCF-1抑制并在慢性感染早期即与祖细胞分异。陈则宇等开发了新的虚拟时间(pseudotime)算法state transition inferencepredictor (STIP)并揭示了在细胞分化时间轴上不同转录因子以及转录程序的演变以及相互作用。他们通过STIP发现了TCF-1下游的调控网络并通过TCF-1敲除及过表达证明TCF-1直接诱导转录因子Eomes和Myb表达。这一工作进一步阐明了耗竭T细胞异质性随时间推移的演变以及调控这一过程的转录网络的构架。其工作对深入理解免疫疗法如何促进耗竭T细胞的免疫反应有指示性作用。该工作所揭示的新亚群在组织中的分布、对抗病毒及抗肿瘤免疫反应的作用、以及对机体的病理性影响仍将吸引未来的进一步探索。https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(19)30409-1
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