专家点评Nature | 找到尼古丁成瘾与糖尿病并发关键纽带

原创陈文强 BioArt

点评 | 胡海岚、董一言 (浙江大学)

解读 | 陈文强 (哈佛医学院张毅组博后)

责编 | 兮

众所周知，吸烟不仅是肺癌最重要的致病因素，更与心血管疾病、代谢相关疾病息息相关。多项流行病学证据【1-2】均指出，长期吸烟能显著增加2型糖尿病风险。作为烟草致瘾的主要化学成分，尼古丁 (俗称烟碱)具有强化刺激效应 (reinforcement)，其致瘾的主要原因被认为是尼古丁作用于中脑多巴胺能神经元产生奖赏效应。与可卡因、毒品等其他精神活性物质一样，吸烟者往往在强制戒烟时遭受戒断症状 (withdrawal symptoms)，造成躯体及心理的极大痛苦。因此，揭示尼古丁成瘾的神经生物学机制具有重要的科学意义及社会效应。

近年来，研究人员越来越多地关注于编码负性情绪的关键脑区——缰核 (habenula)【3】。越来越多的研究证据表明，缰核参与如抑郁症在内的多种神经精神疾病进程。浙江大学胡海岚教授带领的团队在外侧缰核介导抑郁症核心症状的机制研究上取得了一系列国际上令人瞩目的成就。该课题组与外侧缰核相关的系列原创工作分别于2013年发表在Science【4】及2018年两篇长文“背靠背”发表在Nature【5-6】（见BioArt报道：两篇Nature长文丨胡海岚团队抑郁症研究的重大突破），不仅阐明了氯胺酮快速抗抑郁的全新机制，并揭示多个崭新的抗抑郁分子靶点。解剖学上，缰核位于丘脑后部上方近中线处，左右对称，每侧缰核可分为内侧缰核与外侧缰核两部分。除了外侧缰核，内侧缰核的功能也逐渐被揭示。北京脑科学与类脑研究中心、北京生命科学研究院罗敏敏研究员领导的课题组于2011年在Neuron杂志发文【7】揭示内侧缰核胆碱能神经元至脚间核 (IPn)的投射可同时释放谷氨酸及乙酰胆碱两种经典神经递质，引发不同神经元反应，这一发现被认为是修正了神经科学领域的经典“Dale法则”。随后该课题组于2016年在Cell杂志上发文【8】揭示内侧缰核胆碱能神经元的GABAB受体调控恐惧记忆表达及消退（见BioArt报道：NIBS罗敏敏组在Cell发表重要文章）。那么，编码负性情绪信息的缰核是否在强制戒烟时出现的戒断症状中发挥作用？

事实上，尼古丁成瘾领域的研究人员早就将目光投向缰核。烟碱乙酰胆碱受体多个亚基(nAChR)在内侧缰核具有选择性高表达 (图1，笔者摘自Allen Brain Atlas ISH数据库)，提示可能参与尼古丁成瘾的戒断症状【9】。随后研究也证实缰核-脚间核系统的尼古丁受体在尼古丁成瘾中具有重要作用【10】。

图1. Chrna4 (左)及Chrnb2(右)在内侧缰核具有高度选择性表达 (摘自Allen Brain Atlas，Entrez ID: 11438及11444)

2011年，时任美国斯克里普斯研究所独立PI的Paul Kenny教授在Nature杂志发文【11】，揭示尼古丁能通过激活α5-nAChRs受体而激活内侧缰核-脚间核环路，从而引起机体对尼古丁的厌恶反应。该课题组的后续工作于2017年在Nature Neuroscience杂志发文【12】，报道尼古丁还可激活存在于后脑、投射至脚间核释放胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的神经元，从而提高内侧缰核介导的兴奋性神经传递，这一效应能抑制尼古丁的奖赏效应而促进对尼古丁回避行为。众所周知，GLP-1为主要在肠道分泌的激素，能促进胰腺胰岛β-细胞分泌胰岛素，其信号通路的主要组成部分包括TCF7L2。那么，研究人员自然而然想回答的问题是，TCF7L2是否可以调控尼古丁介导的奖赏效应？糖尿病进程和尼古丁成瘾是否存在关联？

Paul Kenny教授在接受邀请赴西奈山伊坎医学院担任神经科学学系主任后，领导新的团队继续对这一科学问题进行更加深入的研究。2019年10月17日， Paul Kenny研究组在Nature杂志在线发表了题为Habenular TCF7L2 links nicotine addiction to diabetes的研究论文，揭示了在内侧缰核高度表达的糖尿病相关基因TCF7L2通过激活缰核-胰腺轴而产生尼古丁额外的升血糖效应，从而提供吸烟致糖尿病的神经生物学证据。

首先，研究人员基于罗敏敏研究员揭示的“内侧缰核胆碱能神经元共释放谷氨酸作为脚间核的主要兴奋性来源”的工作【7】，对胆碱能神经元标记有EGFP-L10a的工具小鼠的内侧缰核进行TRAP研究，发现TCF7L2高度富集于内侧缰核胆碱能神经元中，且远远高于在其他脑区的富集程度 (图2b&c)。随后，为研究TCF7L2是否调节尼古丁动机行为，研究人员构建Tcf7l2突变大鼠(Tcf7l2^Mut)，发现与WT Tcf7l2大鼠(Tcf7l2^Wt)相比，Tcf7l2^Mut大鼠对尼古丁静脉自身给药的响应更为强烈 (图2g-h)，却不影响动物对食物奖赏的渴求。因此认为TCF7L2缺失可增加尼古丁摄入量。

图2. TCF7L2富集于内侧缰核并调节尼古丁摄入量

以上突变大鼠实验为全身性TCF7L2突变，那么缰核内的TCF7L2表达是否也能充分调控尼古丁敏感性？随后研究人员使用CRISPR/Cas9系统进一步验证。通过CRISPR/Cas9敲入工具小鼠以Cre依赖方式结合sgRNA，研究人员对目标基因Tcf7l2进行编辑 (图3c)，因此有效降低该工具小鼠内侧缰核Tcf7l2表达量。内侧缰核内定位注射gRNA-Tcf7l2病毒的小鼠可在自身给药实验中注射更多尼古丁 (图3e-f)，而使用siRNA敲减缰核Tcf7l2表达同样可增加尼古丁摄入量 (图3h-k)。

图3. TCF7L2调节缰核对尼古丁敏感性

因TCF7L2也可激活Wnt糖蛋白及胰岛素，为区分这些机制，研究人员立体定位注射多种工具药至内侧缰核，发现仅GLP-1激动剂Ex-4注射可降低尼古丁摄入，而Wnt通路抑制剂及胰岛素均对尼古丁摄入没有影响 (详见原文补充数据Fig. 3)，从而在信号通路水平证实了缰核TCF7L2能调控尼古丁摄入量，并提示GLP-1可调节缰核TCF7L2活性。

在证实内侧缰核TCF7L2能有效调控尼古丁摄入量后，研究人员下一步想要揭示其机制。使用离体脑片电生理记录 (图3l-o)，研究人员发现，内侧缰核注射尼古丁可显著增加Tcf7l2^Wt大鼠脚间核神经元sEPSCs，而在Tcf7l2^Mut大鼠无法观察到，提示TCF7L2可调节尼古丁激活缰核-脚间核的能力，这一机制与TCF7L2本身的转录活性无关。

使用稳定表达α4β2α5-nAChRs的HEK293T细胞结合sgRNA介导的敲减 (详见原文补充数据Fig. 4)，研究人员证实了TCF7L2可调节内侧缰核nAChRs功能。为进一步验证nAChRs的通道机制，研究人员使用药理学手段在离体脑片记录上分离出nAChRs电流后 (图4a)，在内侧缰核以不同频率压力脉冲注射30 μM尼古丁 (0.1 Hz – 1 Hz – 0.1 Hz)进而研究受体脱敏状态 (desensitization)。研究人员发现，Tcf7l2^Wt大鼠的nAChRs电流可快速恢复脱敏状态，而Tcf7l2^Mut大鼠无法恢复 (图4b-c)。这些电生理研究结果提示，TCF7L2通过调节尼古丁引起的脱敏状态的恢复程度来调节缰核nAChRs受体。

图4. 使用电生理记录揭示TCF7L2调节缰核对尼古丁敏感性的机制

因为TCF7L2是转录因子，研究人员自然而然想回答的另外一个重要问题是，TCF7L2突变后能影响哪些与nAChR功能相关的基因表达？研究人员对Tcf7l2^Mut大鼠进行RNA-seq研究并比较内侧缰核和相关脑区 (图5d)，发现TCF7L2突变能上调内侧缰核195个基因 (图5e)，并用生物信息分析预测出cAMP信号通路途径最有可能在内侧缰核内受到扰乱 (图5f)。为进一步验证，研究人员在PC12细胞中结合cAMP荧光素酶报告系统，验证了GLP-1受体激动剂EX-4的作用，还揭示了cAMP类似物具备促进nAChRs恢复脱敏状态的能力 (图5i-j)。可升高小鼠脑内cAMP水平的磷酸二酯酶抑制剂咯利普兰可在尼古丁自身给药模型上逆转TCF7L2敲减所导致的尼古丁摄入 (图5k，笔者认为此处为本文关键数据)，更进一步佐证了cAMP通路的作用。这些数据不仅提示TCF7L2调节缰核nAChRs功能的关键作用，还通过RNA-seq分析鉴定出了cAMP信号通路在尼古丁成瘾中的作用。

图5. 使用RNA-seq揭示TCF7L2调节缰核nAChR功能的机制

笔者认为更有意思的是，RNA-seq发现的161个上调的差异表达基因中，与海马及脚间核的表达情况对比，一半以上仅在缰核上调，且对上调基因的生物信息分析预测出多个通路与能量代谢相关 (此处原文为补充数据Fig. 6)。首先，研究人员首先证实了尼古丁能剂量依赖性地升高血糖浓度 (图6a-c)。为研究尼古丁激活内侧缰核-脚间核环路的作用，研究人员在大鼠上采用化学遗传策略特异性操控内侧缰核-脚间核环路的活动性，发现激活该环路也能升高血糖浓度 (图6d-f)。

为更进一步研究内侧缰核TCF7L2相关信号分子通路对尼古丁自身给药在血糖调节的作用，研究人员在内侧缰核定位注射不同工具药或病毒载体来干扰通路 (图6g-j)，发现GLP-1受体激活可增加尼古丁的升血糖效应，而相反的是，GLP-1受体敲减能降低尼古丁的升血糖效应，对TCF7L2的siRNA敲减同样也能降低尼古丁的升血糖效应。有意思的是，无跨血脑屏障效应的β-受体阻滞药同样能降低尼古丁自身给药的升血糖效应，提示外周作用靶点的存在 (图6j)。最后，为证明外周胰腺器官和中枢存在联系，研究人员使用GFP标记的伪狂犬病毒示踪工具pRV-GFP注射于外周胰腺组织，并发现在内侧缰核和脚间核有GFP表达，并与内侧缰核的胆碱能神经元共标 (图6k-i；原文补充数据Fig.8)。这些数据不仅揭示了尼古丁升高血糖的分子机制，还提示内侧缰核可调控交感神经系统传递，以调控胰腺的血糖释放。

图6. 缰核TCF7L2调节尼古丁的升血糖效应

至此，文章已经证明了内侧缰核TCF7L2可调节尼古丁的升血糖效应，那么，反过来的是，血糖是否可以调节内侧缰核的nAChR功能呢？研究人员使用图2a-c中使用的TRAP小鼠喂食6周蔗糖溶液，发现内侧缰核胆碱能神经元的转录组改变显著，提示循环血糖浓度的增加能调控内侧缰核功能。电生理上也证实了细胞外液葡萄糖对尼古丁诱导nAChR电流的影响 (原文补充数据Fig. 9)。这提示，尼古丁引起的血糖升高能反馈调控缰核神经元，以抑制缰核nAChR功能。这一系列证据也能部分解释吸烟者患糖尿病的高概率，也可揭示为何糖尿病患者更难戒烟。

反复暴露尼古丁致高血糖状态后，在撤药阶段血糖稳态调节是否受到影响？研究人员对大鼠进行长达21天的尼古丁自身给药训练 (即模拟人类长期吸烟)，随后停止训练 (即模拟急性戒烟)后，大鼠空腹血糖浓度显著降低，这一低血糖状态可部分解释为何吸烟者戒烟早期出现碳水化合物渴求现象。然而，长期撤药 (即模拟长期戒烟)后，与对照小鼠相比，尼古丁自身给药小鼠的空腹血糖浓度显著升高，葡萄糖清除率显著降低，且胰高血糖素及胰岛素均显著增加 (图7a-e)，而胰高血糖素及胰岛素循环水平增加正是空腹阶段机体为维持血糖稳态的快速反应机制。研究人员的这一数据正好佐证了尼古丁对饥饿引起的正常机体代偿性适应调节产生显著影响。

为证明内侧缰核TCF7L2是否可调节这一代偿性适应，研究人员使用Tcf7l2^Mut大鼠，研究21天慢性尼古丁注射对血糖稳态调节是否有影响 (笔者注：此处并未使用尼古丁自身给药模型)。研究发现，尼古丁处理前的血糖浓度及胰高血糖素浓度均无差异，盐水注射对Tcf7l2^Mut或Tcf7l2^Wt大鼠的血糖稳态调节均无影响，而尼古丁注射仅能显著增加Tcf7l2^Wt的血糖及胰高血糖素浓度，而对Tcf7l2^Mut大鼠无效应，这一数据提示TCF7L2能调节尼古丁慢性给药动物出现的糖尿病样血糖稳态调节异常。

图7. TCF7L2调节尼古丁促糖尿病效应

总而言之，本文始于研究内侧缰核富集的糖尿病相关基因TCF7L2，通过TCF7L2全身性突变及缰核内TCF7L2的一系列敲减 (CRISPR-cas9系统、siRNA等)，不仅以电生理及药理学手段揭示了TCF7L2调节内侧缰核神经元nAChR受体功能，还通过生物信息分析内侧缰核下调基因组，并揭示了依赖于cAMP信号通路的nAChR功能调节，又通过分析内侧缰核上调基因组，并揭示了TCF7L2在能量稳态调节中的重要作用。此外，本文还通过跨突触病毒示踪实验提供了缰核-胰腺轴存在的证据，进一步揭示缰核TCF7L2调节尼古丁的升血糖效应，而反过来循环血糖还可调节内侧缰核nAChR功能。这一系列证据均指出，内侧缰核TCF7L2基因是尼古丁成瘾与糖尿病并发的关键纽带。因此，本文的数据提示，糖尿病和其他吸烟相关疾病(如高血压、心血管疾病等)可能具有中枢机制，这有可能反映在尼古丁引起的缰核与自主神经系统功能紊乱。

笔者想特别指出的是，Paul Kenny课题组在2017年发表的Nature Neuroscience为该系列工作的关键工作之一【12】。该文章的第一作者Luis Miguel Tuesta博士于2013年加入笔者所在的哈佛医学院张毅教授课题组进行博士后训练，去年拿到美国NIH资助的KO1基金并于今年2月在迈阿密大学找到教职，进行独立研究。Luis于今年6月发表了一篇Nature communications【13】，该文被认为是张毅教授课题组神经科学方向的开山之作，这个工作报道了特异分离中脑多巴胺能神经元细胞核的新方法，并发现调控多巴胺能神经元基因表达的关键调控因子Gmeb1（见BioArt报道：专家点评 | 张毅实验室神经生物学领域的开山之作，附论文背后的故事）。Luis将Paul Kenny课题组的看门技术小鼠自身给药 (self-administration)带入了张教授课题组，并使用该技术进行了一系列本课题组的重要工作。笔者在张教授博后期间，主要在Luis的帮助与指导下掌握了小鼠自身给药技术。也亲眼见证了他那篇GLP-1调节尼古丁成瘾的Nature Neuroscience的刊出过程。这篇文章一直以来都是笔者特别欣赏的工作之一。现在更加欣喜地看到Paul Kenny课题组的后续工作发表在Nature。此外，值得一提的是，Paul Kenny组培养的多位博后，如刘欣安博士与陈祖昕博士（也是该文章的作者），均已于今年初加盟中科院深圳先进技术研究院脑所，进行独立研究。期待看到他们在新单位做出的更加精彩的工作！

专家点评

胡海岚（浙江大学神经科学中心执行主任）、董一言（浙江大学神经科学中心博士生）

Paul Kenny教授从2000年博后期间开始研究成瘾，至今已持续耕耘20年。他师从Athina Markou教授，在博后期间发现II型mGluR受体介导尼古丁的戒断反应。2006年独立后，Kenny实验室接连发表重要论文，阐明了一系列调控成瘾的关键分子机制，包括解析了促进可卡因成瘾的纹状体microRNA分子信号通路【14】。

Kenny实验室最引人注目的成果是阐明了大脑中的内侧缰核调控尼古丁成瘾的分子和神经环路机制。在这个方向上，他的研究至今仍在不断地深入。他在2011年首先报导了内侧缰核中尼古丁受体α5亚基的功能缺失，会阻断内侧缰核对下游脑区脚间核的激活，最终减轻尼古丁引起的负性情绪，促进尼古丁成瘾【11】。这有力地解释了之前的人类遗传学发现——尼古丁受体α5亚基突变的人群更有可能对烟草成瘾【15-16】。在2017年他们实验室又进一步发现了调控内侧缰核-脚间核通路的上游脑区孤束核。他们发现，尼古丁会激活孤束核中的一种GLP-1神经元，进而在脚间核分泌多肽GLP-1。GLP-1会激活投往脚间核的内侧缰核轴突，从而激活脚间核，阻断尼古丁的奖赏效应、产生负性情绪、减少尼古丁的摄入【12】。这一系列突破性的工作不仅有助于我们更好地理解尼古丁成瘾，还为临床上更有效地治疗尼古丁成瘾提供了很有潜力的分子靶点。

事实上，GLP-1还是一种主要在肠道分泌的激素，能够促进胰腺中的胰岛细胞分泌胰岛素。Kenny实验室2017年的文章中也发现了抗胰岛素药物能够增强GLP-1的功能，减轻尼古丁成瘾。基于吸烟人群易感糖尿病的现象，一个十分有趣的问题就产生了：尼古丁导致糖尿病的分子和神经环路机制是什么？

最近，Kenny实验室在最新这篇Nature上的突破性工作从分子和神经环路机制的层面，漂亮地回答了这一问题。通过运用精确在体基因编辑、转录组测序、化学遗传操纵、电生理等多个维度的技术，他们发现尼古丁能通过GLP-1信号通路相关的TCF7L2-cAMP信号通路，促进内侧缰核尼古丁受体从脱敏状态中恢复。而当TCF7L2分子通路发生异常时，从内侧缰核到脚间核、最终到下游器官胰腺的这一多级神经环路，会产生功能紊乱，导致类似于糖尿病的血糖异常。由于脚间核几乎是内侧缰核唯一的投射核团，这项最新的工作表明内侧缰核-脚间核通路的下游能够介导尼古丁的促糖尿病效应，从而在神经环路层面将尼古丁的成瘾效应和促糖尿病效应联系了起来，同时精确地揭示了具有脑区特异性的相关分子机制。这为临床上更好地治疗尼古丁成瘾和糖尿病的共病提供了精确的分子靶点。

Kenny实验室的一系列重要工作，较为完整地揭示了尼古丁成瘾的分子和神经环路机制，强调了内侧缰核在介导成瘾和负性情绪中的中心地位。这与近十几年来发现的缰核功能一脉相承，为中枢负面情绪核团与外周代谢调节的联系提供了直接证据，在这一方向上是突破性的进展。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1653-x

参考文献

1. GBD 2015 Tobacco Collaborators. (2017) Lancet. Smoking prevalence and attributable disease burden in 195 countries and territories, 1990-2015: a systematic analysis from the Global Burden of Disease Study 2015. 389(10082):1885-1906.

2. Willi C, Bodenmann P, Ghali WA, et al. (2007) JAMA. Active smoking and the risk of type 2 diabetes: a systematic review and meta-analysis. 298(22):2654-64.

3. Mastumoto M and Hikosaka O. (2007) Nature. Lateral habenula as a source of negative reward signals in dopamine neurons. 47(7148):1111-5.

4. Li K, Zhou T, Liao L, et al. (2013) Science. βCaMKII in lateral habenula mediates core symptoms of depression. 341(6149):1016-20.

5. Yang Y, Cui Y, Sang K, et al. (2018) Nature. Ketamine blocks bursting in the lateral habenula to rapidly relieve depression. 554(7692):317-322.

6. Cui Y, Yang Y, Ni Z, et al. (2018) Nature. Astroglial Kir4.1 in the lateral habenula drives neuronal bursts in depression. 554(7692):323-327.

7. Ren J, Qin C, Hu F, et al. (2011). Neuron. Habenula "cholinergic" neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes. 69(3):445-52.

8. Zhang J, Tan L, Ren Y, et al. (2016). Cell. Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression. 166(3):716-728.

9. Salas R, Pieri F, De Baisi M. (2004). Journal of Neuroscience. Decreased signs of nicotine withdrawal in mice null for the beta4 nicotinic acetylcholine receptor subunit. 24(45):10035-9.

10. Salas R, Sturm R, Boulter J, De Baisi M. (2009). Journal of Neuroscience. Nicotinic receptors in the habenulo-interpeduncular system are necessary for nicotine withdrawal in mice. 29(10):3014-8.

11. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, et al. (2011). Nature. Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake. 471(7340):597-601.

12. Tuesta LM, Chen Z, Duncan A, et al. (2017). Nature Neuroscience. GLP-1 acts on habenular avoidance circuits to control nicotine intake. (5):708-716.

13. Tuesta LM, Djekidel MN, Chen R, Lu F, Wang W, Sabatini BL, Zhang Y. (2019) Nature Communications. In vivo nuclear capture and molecular profiling identifies Gmeb1 as a transcriptional regulatoressential for dopamine neuron function. 10(1):2508.

14. Hollander JA, Im HI, Amelio et al., (2010) Nature. Striatal microRNA controls cocaine intake through CREB signalling. 466(7303):197-202.

15. Bierut LJ, Stitzel JA, Wang JC, et al. Am J Psychiatry. Variants in nicotinic receptors and risk for nicotine dependence. 165(9):1163-71.

16. Thorgeirsson TE, Geller F, Sulem P, et al. Nature. A variant associated with nicotine dependence, lung cancer and peripheral arterial disease. 452(7187):638-642.

继续滑动看下一个