PNAS：微生物组分析揭示人类皮肤的独特性
PNAS-综合分析皮肤微生物组揭示人类皮肤独特性并提供哺乳动物系统发育共生的证据
Comprehensive skin microbiome analysis reveals the uniqueness of human skin and evidence for phylosymbiosis within the class Mammalia
撰文：和平鸽 中国科学院动物研究所
责编：刘永鑫 中国科学院遗传与发育研究所
原文连接: https://www.pnas.org/content/115/25/E5786
要点
人类皮肤的微生物组与其它哺乳动物显著不同，且多样性明显较低，这可能与现代人的活动规律和卫生习惯有关。
对所有样品而言，宿主来源是否为人类是影响菌群组成的最关键因子。而在非人类来源的样品中，宿主的分类地位（目级水平）是最关键的影响因子，其次是地理位置。
奇蹄类和偶蹄类动物皮肤微生物组具有明显的协同演化现象，为微生物组的组成和宿主的系统发育共生关系提供证据。
部分与人共栖的猫皮肤微生物组与人类相似，狗可能起着连接外界环境与人居环境中微生物置换和传播的作用。
摘要
皮肤是哺乳动物最大的器官，也是动物与外界环境之间的最主要物理屏障，然而影响哺乳动物皮肤微生物组的因子很少有人研究。本研究的主要目的是为哺乳动物皮肤微生物组组成提供基本数据，并检验宿主种类、所在身体部位、地理区域、以及性别对其组成的影响。样品采自177个非人类哺乳动物，代表38种10目，取样于背部、躯干和大腿内侧部位。对所有样品的16S rRNA V3-V4区使用高通量测序技术进行测序。序列数据包括细菌和古菌两个类群。之前使用相似实验方案进行测序，并且已经发表的来自20个人类的皮肤微生物组数据也包含在此次分析中。研究结果显示人类皮肤的微生物组与其它哺乳动物显著不同，且多样性明显较低。与所有样本的微生物组落数据最密切相关的因素是宿主是否为人类。而在非人类来源的样品中，宿主的分类地位（目级水平）是最关键的影响因子，其次是分布的地理位置。比较宿主的系统发育关系和微生物组的亲缘关系，发现奇蹄类和偶蹄类具有明显的协同演化现象，这为微生物组的组成和宿主的系统发育共生关系提供证据。
背景
皮肤是哺乳动物最大的器官，也是动物与外界环境之间的最主要物理屏障。针对皮肤菌群组成特征开展研究对于诊断宿主皮肤的状态非常必要，例如：理解动物与微生物的共进化，阐明微生物与宿主免疫系统的相互关系。此外，皮肤上的微小有机物能够产生一定的化合物，进而影响宿主的生理状态，如种内行为修饰信息素和影响身体气味的有机挥发物等。
前人已对人类体表微生物组的组成特征进行了研究，但针对其它哺乳动物的研究还很少见，特别是使用高通量测序技术开展的研究还较为缺乏。较多的工作旨在探讨宿主种类、地理位置、身体部位以及是否被圈养在影响不同动物类群皮肤微生物组组成中发挥的作用。亦有研究发现健康的猫、狗和牛科动物与生病或者过敏状态的个体微生物组组成显著不同。而对来自五种灵长动物63个样本的研究则发现人类腋窝部位微生物组显著不同于其它种类，具有相对较低的微生物多样性。研究者认为这可能要归因于人类的卫生习惯以及宿主与微生物的进化关系。对来自太平洋北部、南部和大西洋北部海域的驼背鲸皮肤活组织和脱落组织的检测发现虽然不同的种群之间存在较远的地理距离，但它们同时拥有很多相同的菌属。然而，在鲸迁移的过程中，地理位置的变化和鲸饱食状态的不同，皮肤微生物组的组成也会产生变化。对蝙蝠的研究发现宿主种类、地理位置和采样地点是影响其菌群组成的显著因子。对袋獾皮肤和袋囊的研究则揭示地理位置对微生物组多样性的影响较强，而野生和圈养个体菌群组成存在显著差异。总之，这些研究揭示系统发育关系和栖息地可能都会影响皮肤微生物组组成。
在研究中更加广泛取样对于定性微生物与宿主的生态-进化模式或者说是“系统发育共生关系(phylosymbiosis )”非常重要。系统发育共生是指在特定的解剖学部位，宿主的系统发育关系平行于相关微生物组落的生态联系的进程（Phylosymbiosis is the process by which the phylogeny of host species parallels the ecological relatedness of corresponding microbial communities in a given anatomical location）。系统发育共生并不一定暗示宿主与微生物组的协同演化，但协同演化却可能是决定观测到的系统发育共生现象的潜在机制之一。如使用16S rRNA高通量测序发现昆虫的系统发育关系和肠道微生物组亲缘关系就存在系统发育共生现象，但要证明微生物组和宿主的协同演化还需要另外使用其它对于解决系统发育关系更灵敏的分子标记，开展菌株水平的研究。对哺乳动物皮肤菌群可能存在的系统发育共生现象目前还没有研究，而这是证明哺乳动物及其皮肤微生物进化历史的第一步。
本文的研究目标就是产生哺乳动物皮肤微生物组数据库，并鉴别宿主种类、地理位置、卫生状况和身体部位与菌群组成的关系。关于宿主与微生物组成的关系，研究者推测哺乳动物和其皮肤微生物组之间存在系统发育共生关系。在检验系统发育关系是否存在时，将人类的数据移除，因为人类皮肤微生物组组成与其它动物显著不同。
结果与讨论
人类与非人类哺乳动物皮肤微生物组的比较
本研究对来源于589号哺乳动物皮肤微生物组中的细菌和古菌群落16S rRNA基因的V3-V4区域通过PCR扩增测序进行定量分析。识别出22728个独特的可操作分类单元（OTU））。这些分类单元隶属于44个原核生物门级单元。对研究类群的指示物种进行分析发现来源于人类的样品含有相对较高的葡萄球菌（Staphylococcus），表皮葡萄球菌（epidermidis）, 棒状杆菌（Corynebacterium） 和丙酸菌属（Propionibacterium acnes）。而非人类哺乳动物却与节细菌属（Arthrobacter）和鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）等与土壤相关的菌群联系，尽管其平均丰度低于人类的指示类群（表1）。这一发现也被核心OTU分析证实。核心OTU即在至少90%未稀释的数据中出现的个体。所有的哺乳动物都含有6种核心OTU, 来源于节细菌属, 鞘脂单胞菌属和土壤杆菌属（Agrobacterium）三个属。除去猫、狗和人类的其它五个目的哺乳动物进行了单独分析。所有的这些目（除了偶蹄类以外）均含有自己类群特有的菌群种类。
大量与土壤相关的微小有机物的存在代表了这些宿主动物真正的体表微生物组，也反应出这些动物的皮肤与外部环境的频繁接触。虽然本研究的方案并没有去除外界环境的微生物组，如前人在研究两栖动物所采用的方案那样，进一步的研究将考虑不同取样方案以尽量减小对外来微生物的取样。在人类临床应用的研究中，定居者与旅居者微生物组的差异已有研究。从医学的角度讲，如果能够轻易地被消毒剂处理掉，或者用肥皂和水清洗掉，这样的微小有机体就是旅居者。
表1. 人类和非人类动物皮肤菌群的指示种分析
人的皮肤微生物组显著不同于除一些被驯化的食肉目宠物以外的其它非人类哺乳动物（图1）。此外，从多样性来看，人类皮肤的微生物组多样性也显著低于其它哺乳动物，这可以从已明确的OTU数量、香农指数等参数看出来（图2）。这与之前基于五种灵长动物的研究结果一致。而袋鼠目、翼手目、啮齿目和非人类灵长动物皮肤微生物组成则非常相似，在图中混合在一起。随后的多元置换方差分析则显示宿主是否为人是决定微生物组落组成最关键的影响因子。因为人类近期才从非灵长类动物分化出来，演化历史较短（如：猩猩已有12 - 15百万年的演化历史，而狒狒则有21 - 25百万年的演化历史），这些研究结果表明现代人的活动，如大量时间地停留在室内、频繁洗澡、穿衣等都可能影响皮肤微生物组的多样性和组成。非人类哺乳动物部分较高的多样性可能归因于旅居类微生物组的增加。而之前对与世隔绝的印第安人的研究则发现生活方式的改变，如生活在户外，会有较高的皮肤微生物多样性。这进一步支持现代的人类活动可能快速改变皮肤微生物组组成。
图1. 使用Bray–Curtis差异图示哺乳动物不同类群菌群组成的差异
对整个数据而言，随机森林模型基本能够准确地区分人类和其它的动物（98.5 ± 1.2%）。Corynebacterium (2.0%), Propionibacterium acnes(1.2%), Moraxellaceae (1.2%), 和Macrococcus (0.8%)对模型的贡献最高。这些生物也是所有样本中所占丰度最高的前10类群。有一个来自人背部的样品是因为Luteimonas, Planomicrobium 和Planococcaceae的含量较高而与其它动物聚在一起。随机森林模型分析分错的类群是家栖的宠物类群，它们具有较高的Corynebacterium 和 P. acnes。当所有的宠物从数据里面删除后再做分析，人类更加能够清晰地与其它类群区分（99.8%正确率），这比随机抽样数据好78.2倍。
图2. 箱线图展示哺乳动物10目和人类皮肤微生物组的OTU数量和Shannon指数差异
目级分类地位和宿主地理分布影响哺乳动物皮肤微生物组
使用多元置换方差分析检验哺乳动物的分类地位、身体部位和地理分布对皮肤微生物组的影响作用，结果发现哺乳动物的目级分类地位是影响最大的因子，其次是地理分布（图3）。同样，研究者们也使用随机森林分析来检验内在因子和外在因子在影响菌群组成上的作用。同样，目级水平分类的正确率远远高于科、属和种级水平。
图3. 热图显示显著影响动物菌群组成的因子。
具较高多元置换方差检验F值则表示其微生物组组成差异大
对具体来自某个地理位置的样品能否正确分类可能归因于特定栖息地中的土壤。对蜥蜴皮肤及其栖息环境的微生物组的分析就揭示其皮肤和外在环境之间有某些共享类群同时存在。已有研究显示宿主种类是决定蜥蜴皮肤微生物组的最关键因素，而地理位置是第二重要的因素。本文的研究结果与之基本一致。
其它被证明对人类产生影响的因子，如：个性特征、性别、身体部位等却对其它的动物影响并不显著。目级分类地位和地理位置均比性别、身体部位和动物自身更能准确地对研究样品进行归类。这与对人类的研究截然不同：个性特征是影响人类体表微生物组组成最关键的因子之一。不同的动物个体可能微生物组成具有各自的独特性，但是每种动物只有三个样品可能无法得出这样的结论。
猫，狗和马有足够的取样量，因此将其用于分析性别对微生物组的影响。然而，多元置换方差分析揭示性别并不是影响这些动物皮肤微生物组的显著因子。所有已驯化的猫和狗都是被阉割的个体，所以这可能不会对分析产生影响。然而，马既有被阉割的个体，也有保留性别特征的完整个体，性别状态也没有展现出对其皮肤微生物组的显著影响作用。受到性别影响的唯一物种是红袋鼠。
取样部位有显著影响的类群包括奇蹄目和长鼻目。取样部位影响不大可能因为此项研究取样的部位（背部，躯干和大腿内侧）均被毛发覆盖。此前对狗的研究显示毛发覆盖的部位微生物组多样性高于粘膜表面。
为了明确宿主的分类地位的重要性并没有过多地受到取样量大小的影响，另外对取样量比较大的偶蹄目，食肉目和奇蹄目进行了单独分析。这几个类群至少来源于6-8个取样地。结果显示，移除取样量小的类群以后，目级分类地位的影响更加显著，而地理位置的影响则下降了。
宠物与人类皮肤微生物组的关系
虽然多数的动物与人类相比皮肤微生物组存在显著的差异，但一部分宠物却与人类在坐标空间里面聚在一起。尤其是在17个与人类聚在一起的动物样品中，有15个来源于室内生活的宠物，另外两个样来源于2只经常被清洗和梳理的狗的背部 （图1）。总之，这些样品中75%个体的主人也是此项研究中提供人类样本的对象，而所有与人类有相似菌群的猫至少有两个取样部位展现出人类菌群组成的特征，而狗的背部也只含人类菌群的特征。有11只狗与其它动物的菌群类似，这些狗与所有生活在农场和户外的猫类似。有趣的是12只生活在室内的猫中有11只与其它动物类似。它们与一只狗生活在一起。这可能因为狗能够将室外的微生物组带进室内，进而通过建筑环境和接触传播给室内生活的猫。此前已有研究就显示拥有狗能够改变人类和建筑物上面微生物组的组成。
预测人类与其它动物皮肤微生物组功能的变化
FAPROTAX 分析揭示哺乳动物皮肤菌群具有一些保守的功能。一些匹配的功能基于人类微生物组项目委员会（Human Microbiome Project consortium）中来源于人类样品的宏基因组数据预测获得。因为样品来源于哺乳动物，预计会有动物的共生物和人类病源生物。尿素是汗液的组成成分，也能提供氮源，这可以解释尿素分解作为预测到的皮肤功能之一。
图4. 基于FAPROTAX数据库预测菌群的功能。*表示人类和非人类具有显著的差异。
有很多预测的功能在人类和其它动物之间存在显著的差异（图4）。与较低的多样性一致，人类皮肤菌群也具有较少的预测功能。而其它动物的菌群有较多的功能，这也可能因为它们拥有更多来源于土壤的菌群。预测发现人类皮肤菌群具有较高的对锰氧化的功能。人类汗液锰的浓度平均为100 ppb，这样人类每天平均分泌200-300 mg锰。预测锰氧化的功能源于人类皮肤菌群核心OTU种类，P. acnes。相反，其它动物皮肤微生物组的功能预测则与较高的氮循环和单碳化合物降解功能有关。根据FAPROTAX数据库，甲醇氧化与节细菌属（Arthrobacter）中的分类单元有关，而甲基营养化（methylotrophy）与甲基杆菌属（Methylobacterium）中的分类单元有关。氮呼吸与多个生物类群有关，包括副球菌属（Paracoccus）和假单胞菌属（Pseudomonas）。 明白皮肤微生物组是否贡献于氮和锰循环比较重要，因为锰和含氮物质，如一氧化氮的缺乏可能会导致伤口愈合延迟。菌群的代谢物可能也与哺乳动物的衰老有关，因为它们可能改变氧化应激反应。
基于分类的功能预测是阐明皮肤微生物组生化过程如何影响宿主皮肤健康的第一步。肠道微生物组研究取得了许多进展，表明胃肠道内的微生物可以影响消化，并为宿主提供其自身无法合成的维生素和氨基酸，进而通过胃-脑轴影响神经系统的功能。虽然目前尚不清楚皮肤微生物组的生物化学过程如何影响其宿主，但确定哪些过程发生在皮肤上是理解这些微生物功能如何影响皮肤健康的第一步。未来使用宏基因组测序的研究可能有助于确定这些预测的保守微生物功能中哪些是哺乳动物皮肤的核心功能，而哪些是不同宿主物种之间变化的功能。
奇蹄类和偶蹄类明显的系统发育共生现象
系统发育共生可能导致系统发育关系近的动物类群有相似的微生物组。这可以通过Robinson–Foulds 和 matching-cluster 的值来预测，它们比较了两棵系统发育树之间的相关性。 值为0表示两棵树相似，而值为1则表示两棵树不相关。而matching-cluster因为考虑了整个树上的不同支系，因而比Robinson–Foulds 更具统计学的可靠性，因而得出的值在0-1之间有较大的变异范围。先前的研究表明，微生物组落的变化与昆虫体内宿主的进化相匹配，99%的OTU聚类阈值更为明显。本研究采用Bray-Curtis、末权重和权重UniFrac距离方法，基于进行97%和99%阈值的比较。
将宿主动物的系统发育与各宿主物种对应的皮肤微生物组的树状图进行比较表明奇蹄目和偶蹄目动物皮肤微生物组之间的关系与其对应的宿主进化关系显著相关（图5）。使用不同的OTU聚类阈值和距离计算方法均显示奇蹄类具有系统发育共生现象，唯一的例外是来自于驯养马和普尔热瓦尔斯基马的皮肤菌群。马科动物和犀牛科动物之间的分化不能归因于微生物组取样的不同地理位置，比如农场或动物园的栖息地，因为普尔热瓦尔斯基马来自多伦多动物园。偶蹄类的归一化匹配聚类得分0.38，Bray-curtis和UniFrac加权指数均揭示宿主系统发育和微生物树状图显著相关。最大的差异是山羊的菌群基因序列，它们与长颈鹿和驯鹿而不是羊聚在一起。此外，宿主物种并不会根据其来源的地理位置进行聚集。相反，食肉动物并没有展现显著的系统发育共生关系。所有在奇蹄类和偶蹄目取样的动物都是食草动物，以栖息地当地的草为食，而食肉类动物有更多样化的食物。
图5. 奇蹄类、偶蹄类和食肉类皮肤菌群组成与动物系统发育关系的相关性图示
当人和其它哺乳动物在一起分析的时候不能检测到显著的系统发育共生关系，除了未加权的UniFrac测量采用归一化Robinson -进行分析并设定归一化的Robinson–Foulds值为99%阈值。 当从该数据集中删除人类时，相关性略有增加，尽管宿主系统发育和细菌树状图仍然表现出很小的相关性。
尽管之前的研究已经能够证明系统发育共生现象的存在，但它们是在高度受控的实验室条件下和对粪便样本的研究中得到的结果。皮肤是一种受脱落和与其他表面接触影响的短暂环境。这项研究中的动物有几个共同的因素，如不同的地点和年龄。
在此研究中，如果哺乳动物在其生活史上的相似时间点取样，并且居住在相同的地理位置，可能会观察到更明显的一致性。此外，在系统发育共生关系检验中，当所有的OTUs序列都被认为是来自一个群落时，在非人类哺乳动物皮肤上较为丰富的旅居类土壤微生物可能掩盖了系统发育共生的存在。未来的研究应该在清洗皮肤之前和之后进行取样，观察这种方案对分析的影响。
我们假设减少环境中短暂的辅助生物体的数量将加强系统共生的发现，因为不与宿主共同进化的外来微生物将被从分析中移除。
哺乳动物皮肤具有古菌类群
在6,550,625条序列中，仅有6,509序列是古菌。包括耐盐的嗜盐细菌(Halobacteria)， 产甲烷菌(Methanobrevibacter)， 氨氧化菌(Thaumarchaeota)。 产甲烷菌的存在可能源于粪便的污染，因为它是肠道菌群的主要古菌类群。嗜盐细和产甲烷菌， 如Nitrososphaera， 有成为皮肤菌群中的定居者。嗜盐细菌能够耐受来自汗液的盐浓度。推测的氨氧化古生菌也在人类皮肤上有报道。虽然我们的数据中古菌序列较少，但是古菌序列的比例按照取样的个体数量标准化，在取样的动物物种中分布是不均匀的。如在南非大羚羊中古菌序列所占的比例最高，其次是东非狒狒、南非大羚羊和牛科动物。 来自广古菌门（Euryarchaeota）的产甲烷菌是古菌中的主要成分，这是因为拥有较多古菌序列的动物多是反刍动物。 土拨鼠含奇古菌门数量最多，其次是黑尾袋鼠、东非狒狒和矮种马。 综上所述，这些结果扩大了皮肤上公认的氨氧化古菌的已知宿主范围，它的宿主类群超越了人类。然而，本研究使用的引物并不能与所有的古菌类群的16S rRNA基因匹配，因而可能会低估古菌类群所占的比重。
研究方法
取样
研究材料来源于哺乳动物纲10个目，包括不同性别的。有宠物，也有来源于农场、动物园或者野生条件下的个体。样品采集过程中详细记录不同个体的性别、年龄、饮食、地理位置、健康状态、梳洗频率、抗生素给药情况等信息。微生物组取样来源于177个非人类哺乳动物背部、躯干、大腿内侧三个不同部位皮肤的无菌拭子。77个来源于20名人类的样本也包含在其中。取样时将毛发拔到旁边，用无菌拭子来回擦拭10遍。无菌拭子擦拭后稍微转动，挪到临近区域继续擦洗，总共擦拭40来回后，放入塑料保存管并置于-20℃冰箱保存。所有参加采样的人员都经过统一的培训以确保取样方案的一致性。
测序
16s RNA V3-V4 区， MiSeq 双端测序。
序列数据处理
原始数据用AXIOME V 1.5处理。PANDAseq v2.8 对序列进行快速拼接。QIIME v1.9.0中的UPARSE实现重头聚类和嵌合体与单体（Singleton）的移除。PyNAST v1.2.2实现序列比对。参考Greengenes database v13.8 使用RDP v8.1 对序列进行分类。每个样品稀释取样，保留1654条序列。ɑ多样性和置换多元方差分析（PERMANOVA）使用1000 次重复，以避免未充分获得多样性信息。稀释曲线显示多次稀释能够避免多样性水平的丢失。
统计分析
QIIME 命令中的multiple_rarefaction.py, alpha_diversity.py, collate_alpha.py, 和 compare_alpha_diversity.py用于获取所有样本的ɑ多样性数据。对42项实验设计分组方案进行比较，因为要检验的预设假设比较多，为了避免获得假的正相关结果，分析中使用Bonferroni校正。β多样性基于Bray–Curtis 距离产生的样本间位置关系进行可视化。Rstudio 中的phyloseq (v1.14.0) 和ggplot2 (v2.1.0)两个软件包进行分类层级的计算，并用热图进行可视化。
系统发育共生分析
研究动物之间的系统发育关系基于线粒体COX1进行重建。序列使用Muscle v3.8.31进行比对。使用RaxML 在线工具进行系统发育树的构建。系统发育树的结构经检测与已经较为认可的哺乳动物系统发育结构一致。
微生物组的亲缘关系图使用QIIME v1.9.0中的 jackknifed_beta_diversity.py构建。在特定的分类等级水平，物种被稀释到所有物种的最小的序列数。经过这样的处理，所有哺乳动物的样品均包含1900条序列，而偶蹄类每个样包含9100条序列，食肉类包含25700条序列，奇蹄类包含17500条序列。稀释分析进行了1000次，并构建1000次分析的一致树以修正稀释过程中少量数据带来的偏差。以上所述每个哺乳动物支持体表微生物组的一致性亲缘关系图基于Bray–Curtis距离，OTU分别按97%和99%OTU相似阈值构建。
宿主系统发育关系与体表微生物组亲缘关系之间的联系用normalized Robinson–Foulds和normalized matching-cluster 分值计算。这些分值由R软件包中的Ape包和Brooks等人提供的Python脚本分别计算获得。分值是否显著通过用表皮微生物组亲缘关系图上相似的分支单元节点构建100,000棵随机树，并将这些树与宿主系统发育关系进行比较，用等于或者更高的Robinson–Foulds分值或匹配值计算随机的亲缘关系树的数量。
Reference
Ross AA, Mueller KM, Weese JS, Neufeld JD. 2018. Comprehensive skin microbiome analysis reveals the uniqueness of human skin and evidence for phylosymbiosis within the class Mammalia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 115(25):E5786-E5795.
葛德燕 中科院动物所 副研
主要从事动物系统进化研究，重点探讨不同时期地质气候变化事件对不同生态型动物类群的演化进程与当前生物多样性格局产生的影响，重要功能基因和形态特征的适应性演化。2018年底开始应用宏基因组方法对哺乳动物食性选择和肠道微生物群开展研究。曾参与国家自然科学基金，中国科学院知识创新工程等多个项目的研究工作。目前参与国家自然科学基金，科技部基础专项《藏东南地区生物多样性考察》等项目，参与国家自然科学基金重点项目《中国动物志.鼠亚科》的编撰。曾主持国家自然科学青年基金一项。目前主持英国皇家学会牛顿高级研究者计划基金一项（2016-2020年），国家自然科学基金面上项目一项（2019-2022年）。已发表科研论文近60篇，参与三部专著的编研，一项专利申请。任《Journal of Zoology》副主编，中国核心期刊《兽类学报》编委，IUCN兔形目动物专家组成员，美国哺乳动物学会特别资助会员。在宏基因组公众号发表《PNAS：影响哺乳动物皮肤菌群组成的因素》、《FM：大熊猫的肠道菌群并没特化发酵纤维素的能力》 、《MER：高通量测序应用于病原体和害虫诊断综述》等。
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