Nat Rev（IF 55.4）高彩霞组综述CRISPR/Cas在农业和植物生物技术中的应用，值得收藏

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编者按

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2019年11月6日，Nature Review Molecular Cell Biology（IF 55.47）杂志在线发表了来自中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞课题组题为“Applications of CRISPR–Cas inagriculture and plant biotechnology”的综述文章。该文章首先重点介绍最新的精准基因编辑技术，例如碱基编辑和引导编辑系统。之后讨论了CRISPR–Cas系统在提高植物产量、品质、抗病性和抗除草剂及繁殖和加速驯化中的作用。最后重点介绍CRISPR-Cas相关联的植物生物技术的最新突破，包括CRISPR-Cas元件递送，基因调控，多重基因编辑和诱变以及定向进化技术。

值得注意的是，去年该课题组在Annual Review of Plant Biology杂志发表题为“CRISPR/Cas Genome Editingand Precision Plant Breedingin Agriculture”的综述文章。能够连续在两大权威顶尖综述杂志上发表关于基因编辑在农业育种中应用的综述文章，也从另一个方面说明了该课题在植物基因编辑领域处在世界领先水平。

随着人口不断增加，全球农业生产面临着前所未有的挑战，故需要培育出对逆境具有更强的抵御能力，单产和质量得到提高的品种。然而，用于农作物育种的常规策略费力，费时且复杂，因此需要更有效且省时的育种方法。而基因编辑系统提供了能精确编辑基因的方法，并为作物改良创造了新的机会。

1. 植物中精确的基因组编辑系统：

脱氨酶介导的碱基编辑和逆转录酶介导的引导编辑技术不涉及DSB形成且不需要供体DNA，因此这些基于CRISPR–Cas的工具可诱导精确的序列编辑，并且在植物中比HDR更有效（见下表和下图）。

2. CRISPR–Cas在作物改良和育种中的应用

（1）作物改良中的应用

与传统的育种方法不同，CRISPR-Cas技术能快速生成理想的性状。在过去2年中，很多研究报道了CRISPR-Cas的使用改善了几种作物特性，包括产量，品质，抗病性和抗除草剂性。

提高产量

在影响产量的众多因素中，控制细胞分裂素稳态是提高谷物产量的一种实用方法。通过基因编辑方法编辑水稻中的细胞分裂素激活酶或敲除编码细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（CKX）的基因都能得到高产表型。此外，通过敲除参与营养分配的编码氨基酸通透酶3的基因，培育出具有高分till数和高产并保持谷物品质的水稻品种。CRISPR-Cas介导的其他基因编辑，包括O. sativa PIN5b（调节穗大小），O.sativa GS3（调节穗粒大小）和普通小麦GW2，O.sativa GW2和O. sativa GW5（调节粒重），也导致作物的产量增加。除谷物外，研究人员还通过编辑控制分生组织大小的CLV 40和ENO 41，提高了水果作物的产量。

提高品质

谷物中的直链淀粉含量与品质有着重要的作用，通过靶向编辑针对形成支链淀粉生物合成途径的淀粉支化酶，创建了具有较高直链淀粉含量的水稻。此外，通过使用CRISPR-Cas靶向面筋基因的保守区域，已经建立了低面筋小麦品系。

抗病能力

使用CRISPR-Cas破坏宿主感病基因是保护植物免受生物胁迫的一种更有前途的方法。如通过突变水稻中的SWEET11、SWEET13和SWEET14的启动子，产生了对X. oryzae pv 具有广谱抗性的水稻品系。此外，由于具有诱导DSB的能力，CRISPR–Cas9可以被作为切割植物DNA病毒的基因组并赋予病毒抗性。

抗除草剂

乙酰乳酸合酶（ALS）是支链氨基酸生物合成中的关键酶，也是除草剂（例如磺酰脲和咪唑啉酮）的目标基因。对ALS基因中自然发生的点突变的研究表明，ALS中的特定氨基酸替代可以带来除草剂耐受性。因此，使用CBE系统可以赋予水稻除草剂抗性同时保持ALS活性。乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）是脂质生物合成中的关键酶，也是另一个有价值的除草剂目标。

（2）作物育种技术中的应用

尽管CRISPR–Cas已显示出改良作物的强大能力，但将其与常规育种方法结合将进一步有利于农业生产。

单倍体诱导

与传统方法产生纯合性需要六到八代的自交相比，双单倍体技术可以在两代内稳定杂交系的遗传背景。编码花粉特异性磷脂酶A1的MATRILINEAL（MTL）中的移码突变可以触发合子中父本染色体的消除，从而导致单倍体玉米胚的形成（如下图）。

产生雄性不育系

CRISPR–Cas基因编辑提供了一种在可转化品系中建立雄性不育性的快速方法。通过编辑雄性不育1（Ms1）和Ms45，其编码一个锚定脂质转移蛋白和胡豆合酶样酶，使得六倍体小麦栽培品种变成雄性不育。

固定杂种优势（【前沿】Nature/Science/Nat Biotech等文章，系统介绍植物无融合生殖研究进展）

CRISPR-Cas诱导的三重突变会产生克隆二倍体配子和四倍体种子。之后通过异位表达可促进MiMe水稻卵细胞中胚胎发生的BABY BOOM 1的异位表达，可以触发孤雌生殖并导致后代在遗传上与雌性亲本相同（如上图2b）。以类似的方式，水稻的克隆二倍体胚胎是通过破坏MTL（受精后导致父本基因组消除）和MiMe基因也可以产生。

消除自交不亲和

通过CRISPR-Cas突变S-RNase，该基因是茄科植物配子体自交不亲和的一个共性基因，已经建立了自交亲和的马铃薯系。此外，通过破坏油菜和甘蓝中的M基因座蛋白激酶和S受体激酶，克服了孢子体自身不相容性。

其他育种技术

远系之间的杂交通常会导致严重的杂种不育，这是由发散等位基因之间有害的遗传相互作用引起的，并阻碍了杂种优势的开发。此外，减数分裂过程中的同源重组很少在所需位点发生，而通过CRISPR-Cas特异性靶向一个亲本等位基因可以在特定位点触发减数分裂同源重组（如下图），打破不良的遗传联系并快速创建近等基因系。

3. CRISPR–Cas加速作物驯化

传统的驯化过程是一个漫长的过程，涉及到许多基因座的变化，其中只有少数基因座在驱动预期结果中发挥关键作用。CRISPR–Cas具有精确基因编辑能力，无疑可以加速农作物的驯化过程。如研究人员使用了多重CRISPR-Cas系统来同时编辑番茄多个基因，包括SP（植物生长习性），SP5G（花诱导），CLV3和WUS（果实大小），MULT（果数），OVATE（果实形状），GGP1（维生素C含量）和CycB（番茄红素含量）使其接近成为一个有吸引力的番茄品种。

尽管CRISPR–Cas加速驯化具有广阔前景，但该过程仍然存在几个瓶颈。由于驯化需要功能基因组学的精确知识，因此需要进行其他研究以获得野生物种和驯化物种基因的基本遗传知识。此外，由于野生物种通常难以再生，因此需要开发强大的转化系统以使其驯化。最后，由于产生理想的品种需要改变几个基因座，因此需要更有效的多重基因组编辑方法。

4. CRISPR–Cas相关的植物生物技术

（1）在植物中的递送CRISPR–Cas元件技术

CRISPR-Cas9在植物中的有效应用需要将CRISPR-Cas元件递送到植物细胞中的强大而通用的方法。两种广泛使用的递送方法-基因抢和农杆菌介导的递送，而这两种方法都需要组织培养程序。因此，迫切需要新颖的递送策略。

从头分生组织

最近，通过将携带形态发生调节因子WUS2，IPT和STM以及sgRNA盒的农杆菌注射到过表达Cas9的本氏烟草中已去除分生组织的修剪位点上，直接从所得芽中获得基因编辑的植物，并诱导突变可遗传。【Nat Biotech重磅】突破瓶颈，新的植物基因编辑方法无需组织培养，可获得稳定遗传材料！

病毒辅助基因编辑

利用植物病毒是一种无需组织培养即可获得基因编辑植物的有前途的方法。【Nat Plants】突破瓶颈，新的植物基因编辑方法无需组织培养，可获得稳定遗传材料

单倍体诱导剂的基因编辑

在某些农作物中，遗传转化仍然局限于特定的基因型，因此极大地限制了育种程序。为了解决这个问题，最近开发了两种递送系统，分别称为“单倍体诱导编辑” 和“单倍体诱导物介导的基因组编辑”（如下图）。在这两种策略中，优良的玉米系都用带有CRISPR-Cas系统的单倍体诱导系授粉。受精后，来自单倍体诱导物系的父本基因组在母本基因组中诱导突变，随后从合子中消除，从而生成具有母本背景的基因编辑的玉米单倍体。同样，通过用稳定表达CRISPR-Cas9的玉米系授粉小麦品种，成功地编辑了两个小麦基因。编辑的单倍体系的染色体可以自然地自发地加倍或通过用有丝分裂抑制剂处理而人工加倍。这些方法不仅巧妙地解决了无法克服的转化问题，而且还产生了纯合子，无转基因的基因编辑植物。

（2）使用CRISPR–Cas进行基因调控

尽管无催化活性的Cas9变体（称为dCas9）缺乏DNA裂解活性，但它们仍保留了sgRNA介导的序列特异性DNA结合活性。dCas9可以防止转录复合体的结合或阻止RNA聚合酶的通过，从而抑制转录。dCas9的使用还可以通过促进或抑制增强子与启动子的相互作用来改变染色质结构以调节基因表达。此外，CRISPR-Cas系统，例如Cas13a和Cas13b还可以靶向RNA，可特异性下调单个转录本。最后，uORF的编辑是上调基因表达的有前途的方法。

（3）条件性CRISPR–Cas系统

现在已经开发了条件CRISPR-Cas系统。通过使用各种组织特异性启动子，Cas9的表达可以限于特定的细胞类型，因此基因编辑可以限于特定的组织或器官。同样，蓝光抑制和红光诱导的CRISPR–Cas系统也已开发。

5. 植物中的多重基因组编辑

多重基因组编辑用于调节基因表达，堆叠性状和控制调节途径，因此促进了先前描述的作物改良，育种和驯化。在植物中开发了许多用于CRISPR–Cas9的便捷高效的sgRNA系统，包括RNA聚合酶III（Pol III）驱动和Pol II驱动的系统，可以控制下表达多个sgRNA（如下图所述等多种）。

6. 诱变和定向进化

除多重基因编辑外，CRISPR-Cas还可以用于高通量遗传研究。由于间隔区序列是可编程基因编辑的唯一决定因素，基于CRISPR–Cas的平台可以轻松扩展以使用sgRNA池，并且是用于高通量功能基因组学筛选和植物定向进化的有前途的工具。

基于CRISPR-Cas的功能基因组学筛选

功能基因组学筛选是一种鉴定负责特定表型的基因的有力方法，而CRISPR–Cas具有可编程和强大的特性，因此可以在植物的单代中进行高通量的基因组规模筛选。

CRISPR–Cas定向进化

定向进化已成为修饰目的基因（GOI）以获得增强或新颖特性的有力方法。尽管已经在微生物中设计了许多定向进化系统，但由于细胞环境和结构的差异，使用这些系统进化的GOI在植物中的行为可能不同。基本的定向进化系统包括两个过程：诱变以产生各种基因型，以及选择以在特定选择压力下富集所需的基因型。鉴于通常使用的定向进化方法是基于容易出错的PCR和引入随机突变的DNA改组方法。

7. 结论与未来展望

CRISPR–Cas已经成为植物基础和应用研究的颠覆性工具。除了由CRISPR–Cas核酸酶诱导的indel突变外，还设计了一系列CRISPR–Cas衍生的编辑器，可以执行精确的基因组操作。这些工具具有无与伦比的基因编辑能力，已帮助创建了数百种具有改良农艺性能的作物品种，并革新了育种技术。

但是，这些多功能工具尚未满足植物基因组操作的所有需求，进一步的开发对于将CRISPR–Cas应用到植物中至关重要。由于某些农业性状是许多数量性状基因座的产物，并且编辑单个基因可能不会产生足够的表型变化，因此开发有效的CRISPR–Cas介导的靶向插入和染色体重排技术以结合或“堆叠”将是有利的突变的等位基因。

由于CRISPR–Cas试剂的传递仍然是植物基因组编辑的主要障碍，因此，开发其他新颖的传递方法将是人们所希望的。纳米材料是有希望的车辆用于递送各种形式CRISPR-CAS试剂，因为它们可以扩散到壁植物细胞无机械辅助而不会造成组织损伤。鉴定与特定理想农艺性状相关的基因也非常需要基础遗传学研究的进展重大突破！任何植物都能进行转基因/基因编辑的方法被开发？来自两篇Nature Nanotech文章报道纳米颗粒！！。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41580-020-00288-9

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