《自然》：癌细胞逃避免疫的182个杀手锏公布！科学家敲掉癌细胞19069个基因，发现大量免疫逃逸基因，它们之间的相互作用让人咋舌

我们都知道癌细胞逃避免疫细胞追杀的方式有很多。

但这个很多究竟是多少呢？

今天，加拿大多伦多大学Jason Moffat领衔的研究团队，在顶级期刊《自然》上发表的研究论文给出了一个让人吃惊的答案[1]。

至少有182种！

研究人员借助CRISPR基因编辑技术，分别敲掉了6种癌细胞系的19069个蛋白编码基因，在细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的选择压力下，最终找到了182个与癌细胞的免疫逃逸相关的基因。

难怪大部分癌症患者对免疫治疗都没有反应。

这项研究得到的数据不仅让我们对癌细胞的免疫逃逸有了更全面的认知，更重要的是还发现了一些出人意料的免疫逃逸基因相互作用（先卖个关子，后文讲）。

▲ 论文首页截图

随着越来越多的免疫治疗药物获批，这种治疗方法正在成为癌症治疗的常用手段之一。也正因为这种常态化，人们对免疫治疗的关注度也在逐渐下降。

不过学界对免疫治疗的热情依旧，因为还有很多患者不能从免疫治疗中获益。也就是说肿瘤还有很多免疫逃逸手段等着科学家去发现，去攻克。

虽然已经有一些围绕患者的免疫逃逸机制的研究[2-4]，但是这些研究仅限于检测经常发生的基因变异。当然，也有一些基于CRISPR技术的免疫逃逸机制研究[5-7]，不过这些工作也缺乏从基因型到表型对免疫逃逸展开系统地研究。

为了在小鼠癌症细胞系中构建一个全基因组表型筛选平台，以系统识别与癌症内在免疫逃逸相关的基因，Moffat和他的同事们先搭建了一个针对19069个蛋白编码基因的CRISPR基因编辑体系。

随后用这套基因编辑系统处理6个癌细胞系，得到的细胞与细胞毒性T淋巴细胞混合，在不同的时间点取样测序，以确定哪些基因与癌细胞的免疫逃逸相关。

▲ 实验流程

经过对数据的初步分析，Moffat团队发现：在6个不同的细胞系中，至少有2000个基因影响了细胞毒性T淋巴细胞对癌细胞的杀伤效果。

这其中有一些是之前已经被科学家发现的老朋友了，例如B2m、Jak1、Jak2、Ifngr1、Ifngr2等基因。

▲ 不同细胞系的筛选结果

为了验证这些基因确实与免疫调节有关，研究人员对这2000多个基因做了基因集富集分析（GSEA），发现它们集中在抗原呈递、Jak-Stat信号和干扰素通路的基因，参与介导了癌细胞对细胞毒性T淋巴细的抵抗力；而集中在坏死、p38丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号和NF-κβ通路的基因则介导了癌细胞对细胞毒性T淋巴细胞的敏感性。

当然了，还有一些之前在调节免疫细胞杀伤力方面未受重视的通路，例如涉及一氧化氮的产生和线粒体代谢的基因，介导了癌细胞对细胞毒性T淋巴细胞的抵抗力；而糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚代谢、胞内体运输、转录调控和自噬相关的基因，则介导了癌细胞对细胞毒性T淋巴细的敏感性。

总的来说，这些基因富集的信号通路都与免疫调节有很好的相关性。

▲ 富集的结果

要想找到合适的药物靶点，还需要寻找那些在各个细胞系中都能稳定发挥同种作用的基因。于是Moffat和他的同事决定进一步缩小包围圈。

他们将至少在3个及以上细胞系中存在免疫逃逸相关作用的182个基因挑了出来，定义为“肿瘤内在核心细胞毒性T淋巴细胞逃逸基因”。

接下来，他们使用来自癌症基因组图谱（TCGA）的数据，将上述182个基因与已确定的抗肿瘤T细胞反应标志物相关联。最终他们发现这182个基因与IFNγ反应和先天性抗PD-1抵抗等之间存在显著的正相关关系。

那究竟是哪些基因影响了癌细胞对IFNγ的反应呢？

深入分析发现影响最大的是Fitm2基因，以及参与到自噬通路的基因（例如：Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atg12和Atg14）。

▲ 与IFNγ敏感性相关的基因

Fitm2的出现让研究人员大感意外，因为这个基因是小鼠脂肪组织储存脂肪所必需的[8]，但此前并未发现它与IFNγ之间存在任何瓜葛。

为了验证Fitm2调节免疫的作用，研究人员在几个癌细胞系中敲除了Fitm2基因，结果没有Fitm2基因之后，癌细胞对细胞毒性T淋巴细胞变得敏感了，换句话说，细胞毒性T淋巴细胞对缺失Fitm2基因的癌细胞杀伤力更强。

而且，与Fitm2基因正常的癌细胞相比，在IFNγ处理后，Fitm2基因缺失的癌细胞死的更多，这种差距肉眼可见。不过在加入抗IFNγ抗体之后，Fitm2基因缺失的癌细胞对细胞毒性T淋巴细胞的敏感性就消失了。

也就是说，细胞毒性T淋巴细胞对Fitm2基因缺失癌细胞的强大杀伤能力，是通过IFNγ介导的。

▲ IFNγ对Fitm2正常（左）和缺失（右）癌细胞的杀伤力

深入研究发现，原来Fitm2是内质网膜稳态的调节器，Fitm2缺失的癌细胞，在IFNγ暴露期间容易受到氧化性蛋白毒性和脂质毒性应激损伤，最终导致癌细胞死亡。

反过来讲，Fitm2基因的存在，实则帮助癌细胞实现了免疫逃逸。

不过神奇的是，如果自噬通路的相关基因与Fitm2一起发生突变的话，这个癌细胞就对IFNγ介导的细胞毒性有了特别有抵抗力。

为什么说它神奇呢？因为自噬通路的相关基因与Fitm2一样，只要单独突变就让癌细胞变得对IFNγ贼敏感。

▲ 自噬通路的相关基因与Fitm2的相互作用

由于自噬对肿瘤的生长非常重要，因此自噬也正在成为抗肿瘤治疗的有吸引力的目标。试想，如果一名接受抗自噬治疗的患者肿瘤中恰好携带Fitm2突变，那这种治疗岂不是在帮助肿瘤逃避免疫系统的打击，加速患者病情的恶化？！

这个结果凸显了基因相互作用对肿瘤免疫逃逸的影响，也让我们见识到了肿瘤免疫逃逸的复杂性。

在单独研究自噬相关基因的时候，Moffat团队再次发现了这种奇怪的相互作用。

他们首先发现一个意外的现象：自噬相关基因突变和Fitm2突变同时出现虽然能让癌细胞对IFNγ有抵抗力，但是在面对细胞毒性T淋巴细胞时，这种抵抗又消失了。

研究人员推测，自噬对癌细胞免疫逃逸的影响可能还依赖于其他细胞因子。果不其然，自噬相关基因的背后还有TNF。用抗TNF抗体对自噬相关基因突变的癌细胞进行预处理，可消除此类癌细胞对细胞毒性T淋巴细胞的敏感性。

▲ TNF对自噬基因Atg12正常（左）和缺失（右两列）癌细胞的杀伤力

随后，研究人员用自噬抑制剂autophinib和TNF联合处理91种人类细胞系，发现在41种细胞中，autophinib和TNF表现出协同杀伤作用。

然而，在研究自噬相关基因之间的相互作用时，奇怪的相互作用又出现了：Atg12与Atg5和Atg16l1之间具有强烈的反向表型。

啥意思呢？

就是说，上面三个基因独立突变的话，都会变得对细胞毒性T淋巴细胞和TNF敏感；但是如果Atg12与Atg5同时突变，或者Atg12与Atg16l1同时突变，就会对细胞毒性T淋巴细胞和TNF表现出强烈的抵抗。

“我们完全没有预料到这一点，”Moffat说[9]。“这个研究结果告诉我们，遗传背景在很大程度上决定了治疗的效果。”

基于Moffat团队的研究成果，本奇点糕感觉我们对癌症免疫逃逸的认知还非常有限，这个复杂领域还有很多未知等着科学家去探索。

不过，Moffat和他的同事仍对未来持乐观态度，他们认为随着对癌细胞中基因相互作用理解的加深，在未来根据肿瘤的DNA数据预测哪种类型的治疗最有效，是有可能实现的。

参考文献：

[1].https://www.nature.com/articles/s41586-020-2746-2

[2].Hugo W, Zaretsky J M, Sun L, et al. Genomic and transcriptomic features of response to anti-PD-1 therapy in metastatic melanoma[J]. Cell, 2016, 165(1): 35-44.

[3].Rooney M S, Shukla S A, Wu C J, et al. Molecular and genetic properties of tumors associated with local immune cytolytic activity[J]. Cell, 2015, 160(1-2): 48-61.

[4].Zaretsky J M, Garcia-Diaz A, Shin D S, et al. Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma[J]. New England Journal of Medicine, 2016, 375(9): 819-829.

[5].Manguso R T, Pope H W, Zimmer M D, et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target[J]. Nature, 2017, 547(7664): 413-418.

[6].Pan D, Kobayashi A, Jiang P, et al. A major chromatin regulator determines resistance of tumor cells to T cell–mediated killing[J]. Science, 2018, 359(6377): 770-775.

[7].Patel S J, Sanjana N E, Kishton R J, et al. Identification of essential genes for cancer immunotherapy[J]. Nature, 2017, 548(7669): 537-542.

[8].Miranda D A, Kim J H, Nguyen L N, et al. Fat storage-inducing transmembrane protein 2 is required for normal fat storage in adipose tissue[J]. Journal of Biological Chemistry, 2014, 289(14): 9560-9572.

[9].https://www.utoronto.ca/news/u-t-researchers-identify-genes-enable-cancer-evade-immune-system

本文作者 | BioTalker

肿瘤与免疫系统之间的战争真是超复杂