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自然界中，细胞合成线性的多肽链，并将其折叠为紧凑的具有特定生物功能和三维结构的蛋白质。蛋白质工程领域的研究者们长期以来致力于通过改变线性多肽聚合物的序列、长度以及立体化学来优化蛋白质的性质和功能。但与化学合成聚合物不同，目前通过改变拓扑结构以探索蛋白质未知应用的实例非常有限。研究者们通过利用计算机科学模拟及分子工具（sortase、split inteins、butelase和SpyTag/SpyCatcher）成功合成了一些如环状（circles）、链环（catenanes）还有结（knots）等不常见的蛋白结构，但是除却一些简单的功能优化，例如热稳定性和酶催化活性，蛋白质拓扑工程学（protein topology engineering）的巨大潜力尚未被充分展现。
近年来，蛋白质工程与材料科学两个学科的交叉融合，有效促进了包括水凝胶在内的许多有吸引力的生物材料的研发。水凝胶是生物医学领域的重要基质材料，利用合成化学组装多功能亲水聚合物获得水凝胶的方法被广泛应用，例如以四臂聚乙二醇（PEG）为基础来编织水凝胶网络。与此同时，利用重组蛋白质构建生物活性水凝胶的方法变得越来越流行。这种新型的水凝胶设计无需任何化学方法修饰，通过遗传编程（修饰DNA序列）可以直接对材料的机械性能和生化性质进行编码。一个有趣的实例是科研人员利用一对可以自发形成共价键的蛋白/多肽——谍捕手/谍标签（SpyCatcher/SpyTag），设计并合成了全蛋白水凝胶——谍网络（Spy network）。但是这一分子网络的形成取决于线性蛋白质聚合物之间的随机扩链和链间交联，因此其空间结构分布不规则且机械性能较弱。
利用大肠杆菌“细胞工厂”表达末端修饰有功能蛋白的星状蛋白质，并用其作为交联中心构建分子网络，所得水凝胶理论上将拥有更精确的空间结构。为了完成这样的设计，需要两种正交的蛋白质相互作用；一种负责在体内将两个线性蛋白质分子组装成一个四臂星状分子，另一个负责在体外将这些四臂分子缝合以形成网络。近日，香港科技大学化学及生物工程学系孙飞教授研究团队，利用谍反应化学（Spy chemistry）和可自发重组的绿色荧光蛋白（GFP）组件——GFP10和GFP11，自主设计了一种基于四臂星状蛋白分子的分子网络，并成功研发了多种全蛋白质水凝胶材料。这些蛋白质水凝胶具有可调的机械性能，受化学小分子/光控制的相变特性，以及简易封装和光控释放细胞/蛋白质的能力（图1）。相关研究论文发表在Cell Press旗下材料学旗舰期刊Matter 上，第一作者为杨中光博士，通讯作者为孙飞教授。该研究的重要合作方还包括北京大学张文彬教授课题组、香港城市大学邓新教授课题组、香港科技大学阎言教授课题组以及香港科技大学郭玉松教授课题组。![]()
图1. “智能”蛋白质水凝胶网络构建思路概略。图片来源：Matter
为了实现四臂星状蛋白的体内合成及分子网络的构建，可自发重组的绿色荧光蛋白（GFP）组件（图2A）和谍反应化学（图2B）在这项工作中被采用。研究者利用pACYC-Duet-1质粒在大肠杆菌体内建立了共表达系统，该质粒编码两个蛋白分子——SpyCatcher-ELP-GFP1-10-ELP-SpyCatcher（B10B，70 kDa）和SpyCatcher-ELP-GFP11-ELP-SpyCatcher（B11B，47 kDa）的基因序列（图2C）。依据设计，在大肠杆菌体内表达过程中B10B和B11B中的GFP1-10和GFP11片段会自发组装形成四臂分子——(SpyCatcher)4GFP，以重组的GFP为核心向外伸展四个SpyCatcher蛋白（图2C）。B10B和B11B在细胞内合成、反应并在体外被纯化，在整个过程中保持的黄绿色证实了GFP组件的稳定重构（图2D）。分子量排阻层析（SEC）结果证明了所得四臂星状蛋白分子(SpyCatcher)4GFP拥有超过90%的纯度（图2E）。![]()
图2. 大肠杆菌体内合成四臂星状蛋白分子(SpyCatcher)4GFP。图片来源：Matter
研究者们将四臂星状分子(SpyCatcher)4GFP和双功能蛋白SpyTag-SpyTag（AA）/三功能蛋白SpyTag-SpyTag-SpyTag（AAA）的高浓度溶液（8%，质量百分比）进行混合反应获得了Spy-G分子网络（图3A）。两种蛋白的混合溶液在5分钟内形成凝胶材料。(SpyCatcher)4GFP + AA在PBS中浸泡48小时之后由于溶解其体积开始减少，而(SpyCatcher)4GFP + AAA在PBS中浸泡48小时达到最大体积之后直到120小时仍保持体积稳定（图3B和C）。5天之后，只有小于百分之十的(SpyCatcher)4GFP+AAA水凝胶溶解至溶液中，展现了出色的稳定性（图3D）。![]()
图3. 合成全蛋白Spy-G水凝胶。图片来源：Matter
通过引入具有不同物理性质的蛋白模块可以定向调控Spy-G水凝胶的机械性能。由于拥有额外的交联中心，(SpyCatcher)4GFP + AAA在流变测试中展现出比(SpyCatcher)4GFP + AA更高的硬度（图4）。除此之外，较短的双功能蛋白SpyTag-ELP(shorter)-SpyTag（ASA，11.5 kDa），和拥有应力松弛（Stress relaxation）特性的双功能蛋白SpyTag-p53dim-SpyTag（AXA）也被用来与四臂分子(SpyCatcher)4GFP 混合交联形成分子网络。(SpyCatcher)4GFP + ASA显示出比(SpyCatcher)4GFP + AA更低的硬度，这可能是因为缩短的ASA蛋白有更高可能性与同一(SpyCatcher)4GFP分子反应形成无效环而非延长聚合物链，因此对网络结构完整性造成破坏（图4）。而(SpyCatcher)4GFP + AXA在流变测试中显示出对于频率的响应，且在弛豫谱（relaxation spectrum）拥有一个主要能量耗散峰（t = 4 s），这些结果证实X蛋白二聚化可赋予水凝胶应力松弛的特性。![]()
图4. 通过改变蛋白模块调控Spy-G水凝胶的机械性能。图片来源：Matter
为探索3D细胞培养方向的应用，研究人员使用Spy-G水凝胶封装、培养果蝇Schneider 2（S2）细胞。经过转染，S2细胞于细胞基质和外膜表达了GFP11-mCherry蛋白分子（红色荧光）。由于GFP组件重组，Spy-G网络发出了亮绿色的荧光，这一特性有利于观察蛋白质水凝胶基质与凝胶内细胞的相互作用（图5）。有趣的是，当膜表面表达GFP11的细胞被包裹在用SpyCatcher-GFP1-10共价修饰的AAA + BBB 谍网络（Spy network）中时，细胞膜表面出现了绿色荧光，这表明GFP重组可以被用于探究细胞-基质的相互作用（图5）。(SpyCatcher)4GFP + AAA也被用于3D培养3T3成纤维细胞（3T3 fibroblasts）。经过5天的培养，细胞在凝胶基质中仍保持均匀分布。该结果表明Spy-G水凝胶在组织工程和细胞移植等方面的应用前景。![]()
图5. Spy-G水凝胶封装培养S2细胞。图片来源：Matter
为了将Spy-G水凝胶“升级”为“智能”光敏水凝胶，光感蛋白CarH在这项工作中被整合到水凝胶分子网络。CarH的碳（C）端结构域CarHC在黑暗中结合AdoB12，自组装成四聚体；在光照的情况下由于AdoB12的光解作用，四聚体解聚为单体（图6A）。蛋白分子SpyTag-ELP-CarHC（AEC，32 kDa）和四臂星状蛋白(SpyCatcher)4GFP由于谍反应化学自发形成了一个新的四臂蛋白分子(CarHC)4GFP，分子量排阻层析（SEC）证实了这一分子的形成和高纯度（图6B和E）。在黑暗中添加对应化学计量的AdoB12后，(CarHC)4GFP（在PBS中为7.4%，质量百分比）在5分钟内从液体迅速转变为固体（图6C）。当暴露于光照条件下，(CarHC)4GFP凝胶在20分钟内经历了快速的固液相变（图6D）。(CarHC)4GFP水凝胶拥有的化学分子/光诱导相变特性证明了使用这种高度模块化的四臂星状蛋白质结构来构建“智能”刺激响应材料的可行性。![]()
图6. 化学分子/光照诱导四臂星状分子(CarHC)4GFP的相变。图片来源：Matter
按需输送治疗药物是十分重要的生物医学应用，由于光相较其它刺激原具有更高时空精度，光照控制的药物释放受到学界广泛的关注。研究者首先使用(CarHC)4GFP水凝胶对3T3成纤维细胞（3T3 fibroblasts）进行封装和光控释放的测试。3D培养5天后，从光照处理后凝胶中释放出的细胞拥有~99%的存活率，证明(CarHC)4GFP水凝胶具有高细胞相容性。耐药铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染会引起诸如慢性肺部感染等传染病。蛋白分子PslG在之前的文献报道中被证实对于铜绿假单胞菌生物被膜的形成具有显著的遏制作用。为了实现PslG的光控释放以抑制致病菌的扩散，蛋白分子SpyCatcher-PslG- SpyCatcher（B-PslG-B或BPB），被共价交联到(CarHC)4GFP分子网络（图7A）。载有PslG的水凝胶在白光照明下会对铜绿假单胞菌菌液中生物被膜的形成起到显著抑制作用（生物被膜量减少50%），这表明光诱导的PslG释放可以有效遏制铜绿假单胞菌扩散（图7B）。这一结果证明使用光敏蛋白水凝胶(CarHC)4GFP在光控药物传输方向的前景。![]()
图7. 光控释放PslG抑制生物被膜（Biofilm）形成。图片来源：Matter
香港科技大学孙飞教授团队利用大肠杆菌体内合成自主设计表达了四臂星状蛋白(SpyCatcher)4GFP，基于此合成了可用于细胞3D培养且机械性能可调的全蛋白水凝胶。除此之外，结合光敏蛋白质CarH，研究者们还研发了“智能”光敏水凝胶(CarHC)4GFP，实现了光控释放生物活性蛋白，例如能够抑制生物被膜形成的酶——PslG。这项研究证实了通过直接组装具有罕见结构的重组蛋白质来构建宏观材料的可行性，为蛋白质拓扑工程在材料科学中的应用提供了新的思路。
Dynamically Tunable, Macroscopic Molecular Networks Enabled by Cellular Synthesis of 4-Arm Star-like Proteins Zhongguang Yang, Yang Yang, Mo Wang, Tingting Wang, Hong Kiu Francis Fok, Bojing Jiang, Wendi Xiao, Songzi Kou, Yusong Guo, Yan Yan, Xin Deng, Wen-Bin Zhang, Fei Sun*Matter, 2019, DOI: 10.1016/j.matt.2019.09.013
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