免疫检查点阻断疗法（ICT）在多种肿瘤模型中都取得了令人振奋的治疗效果。遗憾的是，在临床实验中，不同病人对ICT的响应率差异性较大，有较多病人无法从ICT疗法中获益。尽管研究者们开发出不少联合疗法增敏ICT，但仍无法取得较好的肿瘤治疗效果。针对这种情况，中科院长春应用化学研究所陈学思院士团队田华雨研究员等人开发出一种新型的纳米免疫鸡尾酒疗法，首次结合免疫原性化疗、检查点阻断和细胞外基质清除三个策略，通过多环节促进抗肿瘤免疫循环的方式，在多种肿瘤模型中取得了很好的肿瘤治疗效果。该研究成果发表在近期的Science Advances 上。本篇文章的第一作者为博士生吴嘉言，通讯作者为田华雨研究员。![]()
图1. 新型纳米免疫鸡尾酒疗法的设计思路和创新点。图片来源：Sci. Adv.如图1所示，纳米免疫鸡尾酒疗法由两种肿瘤微环境酸敏感型的高分子药物构成。分别是聚谷氨酸接枝聚乙二醇担载的阿霉素纳米药物（缩写为DOX NPs）和双醛基聚乙二醇/聚乙烯亚胺/聚谷氨酸担载的表达PD-L1沉默基因的质粒和表达透明质酸酶的质粒（缩写为(shPD-L1 + Spam1) NPs）。DOX NPs可以在肿瘤微酸环境下加速DOX的释放，杀死肿瘤细胞，引发肿瘤细胞免疫原性死亡；而(shPD-L1 + Spam1) NPs可以在肿瘤微酸环境下增加肿瘤细胞对纳米颗粒的内吞，原位高效沉默肿瘤细胞表面的检查点分子PD-L1，并分泌透明质酸酶降解肿瘤区域透明质酸，破坏肿瘤细胞外基质（ECM）。这种新型纳米免疫鸡尾酒疗法具有如下四个优势：（I）促进T细胞活化；（II）将肿瘤免疫抑制微环境改善为活化型微环境；（III）增加外周T细胞向肿瘤浸润；（IV）引发强效免疫记忆效应。![]()
图2. 模拟传统的化疗联合检查点阻断治疗B16F10肿瘤。图片来源：Sci. Adv.化疗与检查点阻断疗法结合是目前临床研究常用的增敏ICT的方法。作者首先通过DOX NPs与shPD-L1 NPs的联合治疗，在B16F10肿瘤模型中模拟该联合疗法。如图2所示，化疗和检查点阻断疗法与单用检查点阻断疗法相比，确实取得了一定的治疗效果，但仅能够取得60.6%的肿瘤抑制率，且瘤内T细胞数量相比单用化疗组，并未取得明显提升。最近的一些研究表明，长期处于肿瘤免疫抑制微环境内的T细胞大多会变为功能异常的T细胞，失去响应检查点疗法的能力。因此，想办法增加外周功能正常的T细胞浸润肿瘤是很重要的。此外，还需要改善肿瘤免疫抑制微环境，以阻止免疫抑制因素对已有或新进入T细胞的持续性耗竭。![]()
图3. 纳米免疫鸡尾酒疗法治疗B16F10肿瘤。图片来源：Sci. Adv.作者认为，肿瘤区域的ECM是阻碍外周T细胞浸润，和恶化肿瘤免疫微环境的重要因素。因此，对肿瘤区域的ECM进行清除，将有望和化疗及检查点阻断疗法产生协同效果。透明质酸（HA）是肿瘤ECM的重要组分。因此，作者将表达透明质酸酶的质粒与表达PD-L1沉默基因的质粒采用同一个基因递送系统共载，以减少额外给药的负担。即DOX NPs+(shPD-L1 + Spam1) NPs共同构成了纳米免疫鸡尾酒疗法。如图3所示，这种新型免疫鸡尾酒疗法与传统疗法相比，肿瘤治疗效果提升显著，取得了97.3%的肿瘤抑制率，并有5/6的小鼠肿瘤满足PR（partial response）指标。同时，肿瘤H&E切片数据也表明免疫鸡尾酒疗法能够引发大面积的肿瘤凋亡。![]()
图4. 纳米免疫鸡尾酒疗法治疗结束后的免疫机理表征。图片来源：Sci. Adv.为了对治疗后的免疫机理有更加深入地认识，作者用流式细胞术、ELISA、免疫荧光、RT-PCR等技术对引流淋巴结和瘤内微环境进行了分析（图4）。流式结果表明，在采用免疫鸡尾酒疗法后，淋巴结DC细胞活化比例有明显提升。最重要的是，鸡尾酒疗法组的瘤内CD8+ T细胞相比于传统的化疗加检查点阻断组有大幅度地提升。ELISA表征结果说明鸡尾酒疗法成功降低了瘤内的PD-L1表达水平，并上调了透明质酸酶的表达水平，同时，瘤内的免疫活化型因子，例如IFN-γ、Granzyme B、TNF-α等因子也显著提升。RT-PCR结果显示，鸡尾酒疗法在一些免疫活化型趋化因子、细胞因子方面都高于PBS组。![]()
图5. 纳米免疫鸡尾酒疗法增加外周T细胞浸润。图片来源：Sci. Adv.在之前的假设中，作者认为肿瘤区域致密的ECM会导致免疫抑制微环境，耗竭内部T细胞的同时，阻止外周功能正常T细胞的浸润。为了研究采用纳米免疫鸡尾酒疗法后，外周T细胞的浸润是否得到了改善，作者采用外周T细胞删除剂FTY 720构建了外周T细胞删除模型。如图5所示，FTY 720腹腔注射后，减少了80%-90%的外周血T细胞，证明了模型构建成功。随后，作者研究了外周T细胞删除对PBS组、透明质酸酶基因组（Spam1 NPs）和检查点沉默加透明质酸酶基因组（shPD-L1+Spam1 NPs）肿瘤治疗效果的影响。当小鼠只接受PBS治疗时，删除或不删除外周T细胞对肿瘤生长曲线或瘤内T细胞影响不大，这说明在PBS组中，外周T细胞本身发挥贡献很小。而在Spam1 NPs治疗组中，删除外周T细胞会导致肿瘤生长变快，且瘤内T细胞降低，这说明Spam1 NPs组中，外周T细胞有一部分贡献。而类似的现象在(shPD-L1+Spam1) NPs治疗组中最为明显，(shPD-L1+Spam1) NPs组与(shPD-L1+Spam1) NPs+FTY720组相比，删除外周T细胞极大地降低了原本较高的瘤内T细胞数量，且影响肿瘤治疗效果。说明外周T细胞在这种疗法中起到至关重要的作用。因此，作者得出结论，在ICT疗法针对具有致密ECM的肿瘤时，外周T细胞向瘤内的浸润发挥了关键作用，而透明质酸降解可以极大促进外周T细胞浸润，这也是为什么要在免疫鸡尾酒疗法中引入透明质酸酶基因的原因。随后，作者又对免疫鸡尾酒疗法增加外周T细胞浸润的具体机理进行了进一步探究，作者从血管正常化程度、趋化因子水平、黏附分子水平及细胞外基质（物理屏障）这四个方面进行了对比和归纳总结，并做成了打分表。对比传统的化疗加检查点阻断疗法，鸡尾酒疗法在多数项目上得分更高，更有利于外周T细胞的浸润。![]()
图6. 纳米免疫鸡尾酒疗法引发强效免疫记忆效应。图片来源：Sci. Adv.目前已有的一些研究表明，功能正常的T细胞，而非耗竭性T细胞，在击杀肿瘤细胞后才可以转化为免疫记忆细胞引发长期的抗肿瘤效果。因此，作者推测鸡尾酒疗法可以很好地增加免疫记忆细胞的数量。如图6所示，通过对脾脏效应记忆T细胞的表征，作者证明在一系列对照组中，纳米免疫鸡尾酒疗法具有最高的记忆T细胞数量。这极大地延长了小鼠的中位生存期（PBS组17天，化疗加检查点阻断组21.5天，鸡尾酒疗法组38.5天）。同时，这种强效免疫记忆效应还可以保护小鼠在停药后抵抗模拟的肿瘤肺转移。此外，在支持材料中，作者还在其余肿瘤模型中（4T1、CT26）对鸡尾酒疗法的治疗效果进行了测试，并对其安全性进行了全面的评估，证明了该疗法的普适性和安全性。
综上所述，针对目前ICT疗法响应率低的问题，作者首次提出免疫原性化疗、检查点阻断和细胞外基质清除三者联合治疗策略，并通过肿瘤微环境酸响应型高分子载体巧妙地将治疗药物靶向运输到肿瘤区域，构建了新型纳米免疫鸡尾酒疗法。作者认为，在一个健全的抗肿瘤免疫循环中，一些步骤是必不可少的，包括并不限于：(1) 肿瘤抗原释放，(2) DC成熟，(3) 抗原呈递与T细胞活化，(4) T细胞从外周迁移至肿瘤，(5) T细胞对肿瘤的特异性识别，(6) 有效杀伤肿瘤细胞，(7) 引发免疫记忆效应。在ICT疗法中，它一般只帮助恢复T细胞的杀伤活性，而对上述其他环节影响较小。而作者开发的新型纳米免疫鸡尾酒疗法可以至少影响(1)、(2)、(4)、(6)、(7)几个步骤。考虑到鸡尾酒疗法的成功，作者期望未来能开发出针对抗肿瘤免疫循环更加全面调控的“超级鸡尾酒疗法”，将有利于人们更有效地对抗肿瘤。An immune cocktail therapy to realize multiple boosting of the cancer-immunity cycle by combination of drug/gene delivery nanoparticlesJiayan Wu, Jie Chen, Yuanji Feng, Sijia Zhang, Lin Lin, Zhaopei Guo, Pingjie Sun, Caina Xu, Huayu Tian, Xuesi ChenSci. Adv., 2020, DOI: 10.1126/sciadv.abc7828
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田华雨 博士，中科院长春应用化学研究所、中科院生态环境高分子材料重点实验室研究员、博士生导师，国家杰出青年基金获得者，中组部“万人计划”青年拔尖人才。 主要从事生物医用高分子、基因/药物智能传输体系、核酸诊疗纳米载体、肿瘤免疫药物递送领域的研究，取得的主要业绩有：（1）提出“多重作用协同增效”策略，构建体外高转染性能核酸药物载体；（2）设计系列体内微环境智能响应载体，实现体内高效药物递送；（3）发展多功能药物载体，开发体内核酸纳米探针技术，实现肿瘤和肿瘤相关淋巴结原位基因检测；（4）利用纳米载体增强抗肿瘤免疫治疗。在Prog Polym Sci、Sci Adv、JACS、Angew、Adv Mater 等杂志发表论文150余篇，获权中国发明专利25项，细胞用基因转染试剂实现规模化生产。
https://www.x-mol.com/university/faculty/210333
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