供稿:刘子琦,北京大学
大家好,本期为大家介绍一篇发表于ACS Chem.Biol.的文章“Tumor Cell Attack by Crotalicidin (Ctn) and Its Fragment Ctn[15-34]: Insights into Their Dual Membranolytic and Intracellular Targeting Mechanism”,通讯作者是西班牙庞培法布拉大学(Universitat Pompeu Fabra)的David Andreu和荷兰Janssen Vaccines and Prevention的João M. Freire。图1. 本工作研究内容和方法概览。
作为全球第二大致死因素,癌症一直是困扰人类的难题。当前的化学药物疗法,面临着低选择性、高副作用以及耐药复发等问题,因而人们殷切寻找新的替代疗法。其中,抗肿瘤多肽(anti-cancerpeptides, ACPs)以其更优的选择性等特点而日益受到研究者的关注。Crotalicidin(Ctn)是源自响尾蛇毒液中的一种cathelicidin多肽。先前的研究表明,Ctn及其片段Ctn[15-34]具有优良的抗细菌、抗真菌以及抗肿瘤性质,且在血清中具有较优的稳定性以及对肿瘤细胞的杀伤选择性。Ctn及其衍生物作为一类颇有潜力的抗肿瘤多肽(anti-cancer peptides, ACPs),其作用机制值得进一步的探究。图2. Ctn及Ctn[15-34]的序列。
论文作者在先前的研究基础之上,综合采用了显微成像、流式细胞术以及质谱蛋白质组学等方法对Ctn及其片段Ctn[15-34]对细胞的杀伤过程进行了探究。发现Ctn不仅能够发挥之前人们认为的膜裂解(membranolytic)作用,还能够靶向胞内一些潜在的蛋白靶点,从而影响癌细胞的代谢、细胞周期以及程序性死亡等过程。首先,作者采用了流式细胞术表征了Ctn及Ctn[15-34]对髓系血液瘤细胞U937和人外周血单核细胞(PBMCs)的作用。作者将碘化TO-PRO-3探针与细胞凋亡探针联用,同时表征细胞膜的通透性与Caspase介导的细胞凋亡作用,另将前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)作为细胞形态变化的指标。结果表明,在细胞膜透过性和凋亡诱导方面,Ctn及Ctn[15-34]更倾向作用于癌细胞U937而不是正常细胞PBMCs,印证了Ctn多肽的细胞杀伤选择性。这种选择性可能是由于癌细胞表面高程度糖基化(带有唾液酸、硫酸基等负电性基团)导致其细胞膜更易于与正电性的多肽相作用。图3. 细胞膜穿透性、细胞凋亡以及形态变化的流式表征。a) 流式数据分析示意;b) U397细胞的膜透性(蓝)、凋亡(绿)以及形态变化(红)的浓度相关曲线;c)PBMCs细胞的各指标的浓度相关曲线。
表1. Ctn对U937细胞的作用(以EC50表示)及对PBMCs细胞的作用(以TC50表示)
接着,作者考察了血清环境对Ctn抗癌作用的影响。结果表明,Ctn和Ctn[15-34]的杀伤作用只有在与血清预孵育24和18h之后才会消失。其中,Ctn在与血清孵育6及12h后期活性只有略微减弱(EC50由0.5 μM变为~0.5 μM和0.9 μM);Ctn[15-34]的活性受血清的影响更大一些(18h后活性消失)。以上结果表明Ctn多肽在血清中具有较好的稳定性。图4. Ctn及Ctn[15-34]的血清稳定性。
图5. Ctn及Ctn[15-34]杀伤U937细胞的荧光成像。
其后,作者对Ctn与U937细胞的作用进行了细致的荧光显微成像观察。作者通过偶联羧基荧光素(CF)荧光团对Ctn进行示踪,同时采用荧光探针对核DNA和细胞膜进行了染色。成像结果表明,Ctn在细胞膜和细胞核中都有富集,并且随着Ctn在核中富集量的增加,核DNA的染色程度会减弱,说明Ctn不仅能与细胞膜作用,还能够对核DNA产生影响。为了从时空动态的角度理解Ctn的抗癌作用,作者还分别采用了时间分辨的流式细胞分析和荧光成像分析探究了Ctn杀伤癌细胞的过程。作者基于流式的数据绘制了膜通透性变化、吸收Ctn以及细胞形态变化的动力学曲线,发现Ctn进入细胞的过程具有延滞期-指数期-平台期的特征;成像观察表明一些Ctn分子先在膜表面聚集,再进入细胞。这些现象说明了Ctn多肽除了具有先前认为的直接穿膜作用外,还能够通过内吞进入细胞。进一步通过低温(4℃)抑制内吞作用并增强膜的刚性,Ctn的摄取极大降低;加入不同类型的内吞抑制剂,Ctn的摄取会产生不同程度的降低,但无法完全抑制(图6-d)。这说明了Ctn进细胞的机理是复杂的,其中直接进细胞和网格蛋白介导的内吞可能占主导地位。图6. Ctn及Ctn[15-34]杀伤U937细胞的动态观察。
Ctn及Ctn[15-34]在胞内的富集引起了作者的兴趣。为了进一步探究Ctn是否能够与胞内蛋白作用以及与那些蛋白作用,作者采用了亲和纯化-蛋白质谱组学的策略对该多肽可能的相互作用蛋白质组进行了探究。通过将N端融合生物素标签的Ctn及Ctn[15-34]与U937细胞裂解相孵育,再通过链霉亲和素树脂进行亲和纯化并进行蛋白质谱分析,作者获得了Ctn及Ctn[15-34]的相互作用组学信息。扣除空白对照,作者鉴定到了154个Ctn的互作蛋白以及132个Ctn[15-34]的互作蛋白,其中有50个为二者共有。进一步对蛋白质组进行GO功能分析,结果表明Ctn可能的互作蛋白质功能涉及到代谢mRNA处理、翻译、分子转运等过程;通过KEGG通路分析,发现Ctn可能的互作蛋白多于核酸代谢相关的一些通路相关。有趣的是,片段Ctn[15-34]可能的互作蛋白质组中有一些与细胞周期相关,而这类功能又与细胞的生长与死亡密切相关,暗示其中可能存在着该多肽的诱导细胞死亡的作用靶点,从而解释流式和成像中观察到的细胞凋亡现象。综合上述发现,作者认为将Ctn的杀伤作用归结为膜裂解诱发的细胞坏死是过于简单化的,其机理应该还包括对胞内潜在靶点的作用。图7. Ctn及Ctn[15-34]的相互作用蛋白质组学分析。
图8. Ctn及Ctn[15-34]杀伤癌细胞的可能模式。
综上,作者综合了包括流式分析、荧光成像和质谱蛋白质组学在内的技术对蛇毒多肽Ctn及Ctn[15-34]对癌细胞的杀伤作用进行探究。基于实验结果,作者提出了大致的机理:首先,Ctn多肽以其正电性与负电性的癌细胞膜相作用,实现膜上富集;之后Ctn既可以直接作用于细胞膜以损伤细胞,又能通过内吞作用进入细胞并与胞内蛋白互作,以诱导细胞的坏死或凋亡。因此,Ctn在癌细胞杀伤中扮演了双重角色。尽管更加具体的作用机制仍有待阐明,该工作无疑加深了人们对蛇毒多肽抗癌作用的认识。对于蛇毒多肽Ctn的具体分子作用机制的探索,以及作为潜在抗癌药物的研究,将成为可期的方向。此外,本工作还体现了时空动态的研究方法在化学生物学研究中日益重要的作用。ACS Chem. Biol.2020, ASAPPublication Date: October 6, 2020https://doi.org/10.1021/acschembio.0c00596Copyright © 2020 American Chemical Society
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