推荐阅读文章 | 16S/18S/ITS扩增子高通量测序引物的生物信息学评估和改进
推荐阅读文章
16S/18S/ITS扩增子高通量测序引物的生物信息学评估和改进
吴悦妮 冯凯 厉舒祯 王朱珺 张照婧 邓晔
扩增子测序的使用极大地促进了土壤、水体、空气等环境中微生物生态的相关研究，16S rRNA、18S rRNA和ITS是这个过程中常用的标记基因。随着高通量测序技术的不断发展和参考数据库的不断更新，针对不同的环境样本的引物选择和改进仍然需要更深入的校验。本研究收集了目前在微生物群落研究中被广泛采用的标记基因扩增通用引物，采用最近更新的标准数据库对这些引物进行了覆盖度和特异性评价。结果表明，EMP推荐的引物依然具有较高的覆盖度，而其他引物在覆盖度及对特定环境或类群的特异性上也各有特点。本研究为微生态研究中标记基因的引物选择提供了一个广泛的指导。
摘要
【背景】在过去的十几年里，基于核糖体RNA基因的扩增子测序技术被广泛用于各种生态系统中微生物群落的多样性检测。扩增子测序的使用极大地促进了土壤、水体、空气等环境中微生物生态的相关研究。
【目的】随着高通量测序技术的不断发展和参考数据库的不断更新，针对不同的环境样本的引物选择和改进仍然需要更深入的校验。
【方法】本文收集了目前在微生物群落研究中被广泛采用的标记基因扩增通用引物，包括16S rRNA基因扩增常用的8对通用引物和2对古菌引物、9对真菌转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)基因扩增引物，以及18S rRNA基因扩增的4对真核微生物通用引物和1对真菌特异性引物。这些引物中包括了地球微生物组计划(Earth Microbiome Project，EMP)推荐的2对16S rRNA基因扩增引物、1对ITS1基因扩增引物和1对18S rRNA基因扩增引物。采用最近更新的标准数据库对这些引物进行了覆盖度和特异性评价。
【结果】EMP推荐的引物依然具有较高的覆盖度，而其他引物在覆盖度及对特定环境或类群的特异性上也各有特点。此外，最近有研究对这些通用引物进行了一些改进，而我们也发现，一个碱基的变化都可能会导致评价结果或扩增产物发生明显变化，简并碱基的引入既可以覆盖更多的物种，但同时也会在一定程度上降低关注物种的特异性。
【结论】研究结果为微生态研究中标记基因的引物选择提供了一个广泛的指导，但在关注具体科学问题时，引物的选择仍需数据指导与实验尝试。
图1 8对原核生物16S rRNA基因扩增引物及其相对位置
Figure 1 Eight primers and their positions for 16S rRNA gene amplification in prokaryotes
图2 真核微生物核糖体DNA结构示意图
Figure 2 Structural diagram of eukaryotic microbial ribosomal DNA
图3 SILVA 16S rRNA基因全长序列数据库物种组成(门分类单元)
Figure 3 The composition of SILVA database for 16S rRNA gene full-length sequences in phylum level
图4 16S rRNA基因扩增引物在SILVA 16S rRNA基因全长序列数据库中的覆盖度
Figure 4 Coverage of 16S rRNA gene amplification primers in SILVA 16S rRNA gene full-length sequence database
图5 16S rRNA基因古菌扩增引物在SILVA 16S rRNA基因古菌序列数据库中的覆盖度及其对古菌的特异性
Figure 5 Coverage of 16S rRNA gene archaea amplification primers in SILVA 16S rRNA gene archaea database and their specificity to archaea
图6 ITS扩增引物对于Unite ITS 3个数据库和海洋真菌ITS 3个数据库的覆盖度
Figure 6 The coverage of ITS amplification primers to 3 Unite databases and 3 marine ITS fungal databases
图7 18S rRNA基因扩增引物EukBr改进前后对于ITS1数据库的覆盖度
Figure 7 18S rRNA gene primer EukBr’s coverage of ITS1 databases before and after the improvement
图8 18S rRNA基因扩增引物对于对应数据库的覆盖度
Figure 8 Coverage of the 18S rRNA gene amplification primer to their corresponding database
长按二维码关注
微生物学通报
Microbiology China
http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn
010-64807511
tongbao@im.ac.cn
本期制作：赵彬涵
点击“阅读原文”获取全文