科研 | Journal of Ecology：植物种内变异通过其地下根际微生物组调节养分循环
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编译：沐秋，编辑：小菌菌、江舜尧。
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1. 植物遗传变异可以决定地下部微生物群落的组成。物种内的变异在生态学层面上影响重大，尤其是其通过营养级联造成的影响。研究者假设树宿主的种内基因型变异可能会影响其根际微生物群落的系统发育组成，这可能会通过特定的进化枝进一步反映在生态系统进程速率中。
2. 研究者通过测定其共生的外生菌根真菌和根际细菌的系统发育结构，检验了松属植物特异性基因型内变异是否参与调节营养循环。研究者在三个45年前的普通花园实验中对属于三个基因型变种（地中海、大西洋、非洲）的松树根际的真菌和细菌分子标记进行了测序，并对七种土壤酶活性进行了测定。
3. 基于不同海拔和不同土壤条件的局部效应是外生菌根和细菌群落在树木根际繁衍的强预测因子。跨位点的变异也解释了磷循环的差异。然而，研究发现植物基因型对根相关微生物群的系统发育结构有显著的影响，在不同地点这种作用表现一致。
4. 地中海植物基因型拥有最截然不同的根微生物群，其中优势菌种担子菌和变形杆菌对系统发生微生物群落结构有着强烈的影响，且与纤维素、半纤维素和甲壳素的含量增加有关。而大西洋基因型中，数量较少的子囊菌和多达13个细菌门共同构成了系统发育的微生物结构。外生菌根真菌解释了纤维素酶和蛋白酶的活性，细菌解释了半纤维素酶和几丁质酶的活性，说明存在功能互补作用。
5. 这是第一份使用稳定森林中三个长期常规花园来分离植物基因型和位点特异性驱动因素对根际微生物群及其酶的潜力的报道。结论：初级生产者的种内变异在相互作用者和分解者中留下了系统发育特征，进一步调节碳和氮循环的关键步骤。这些结果强调了植物种内多样性在决定控制生态系统生产力和性能的基本植物-土壤反馈中的生态相关性。
论文ID
实验设计
本研究是在三个大约45年前的松林中进行的，松林的树木分别来自西班牙中部的Cabaneros(39º22N, 4º24W)、Riofrio(39º8N, 4º32W)和Espinoso del Rey(39º36N, 4º48W)。表S1总结了三个地点的一般土壤和气候特征。所有地点的气候条件相似，年平均温度在10.2至13.4°C之间，降水量在716至800mm之间（表S1）。其他非生物条件则有所不同。Cabaneros海拔1045米，Riofrio和Espinoso海拔分别为775米和830米（表S1）。Cabaneros土壤P、N含量和水分含量均明显较高，C:N比值较低。同样，Cabaneros的有机质含量也较高，与Riofrio相比，两个地点的土壤pH值都较低（表S1）。
所有地点的种植园遵从随机完整的小区设计，每个小区包括四个区块，每个区块包括16棵来自不同地理位置的树，种植间隔2.5米。在这里，研究者通过分析来自四种不同地理起源的树木，研究了每一种表现出典型基因和表型不同的海岸松种源。研究者在每个基因型和实验区块中选择了三棵树，共有108棵树（3个位点×3个植物基因型×4个区块×3棵树）。然而，由于其中一个地点（Espinoso del Rey）的防火带曾被打开，因此缺少6棵树，最后采集了102棵树。
土壤采样是在2012年春天的生长季节进行的，树冠C大量排到根部，导致细菌和真菌活性升高。在清除枯枝落叶层后，在四个基点距离树干1米处挖10×10×20cm（长×宽×深）的坑，采集四个样本。每棵树采集的四个样本合并成一个样品。将样品在4℃条件保存。分离根（直径<2 mm）与土壤，根际土壤与细根。然后用自来水在2毫米和0.5毫米筛子上轻轻地清洗根部，以收集细根尖。将根际土壤样品按基因型和试验区汇集成复合样品进行化学和酶分析（n=35）。在-20℃下收集和储存根际土壤样品。将剩余的大块土壤风干并过筛（2 mm），测定其理化性质。在立式显微镜下观察细根，每个样本随机选取约1.5g（鲜重）外生菌根尖冷冻干燥，研磨，以备后续的分子分析。
用试剂盒从生态菌根根尖和根际土壤中提取基因组DNA。将每株基因型和试验区3个重复株的DNA混合，共得到35个生态菌根根尖DNA和35个根际土壤DNA样品。用ITS1F-ITS2扩增内部转录间隔区ITS-1扩增生态菌根根尖DNA，用细菌引物27F和519R扩增土壤DNA的16S rRNA。建立真菌和细菌扩增产物的独立文库，并使用Roche 454-GS-FLX钛仪器和试剂（美国Roche Applied Biosystems）对样品进行测序。
分别获得106789个真菌序列和361880个细菌群落序列。经过分解、过滤和修剪之后，对于真菌序列，使用真菌ITSx v1.0.3提取ITS1，去除短序列、嵌合序列和单核苷酸。使用USEARCH v8.0.1616执行去复制和聚类。操作性分类单位（OTU）是在97%的相似阈值下生成的。对于细菌序列，使用RDP在80%的置信阈值将代表每个OTU的序列分配给细菌分类群。
利用Phylocom4.2和Beast 1.5.4评估了来自301个生态菌根OTU的真菌系统发育。研究者生成了一棵真菌发育树，其主要节点的拓扑和年龄估计来自于文献中的系统发育信息。利用RAxML 7.3.0对2650个细菌OTU进行了分类系统发育关系的重建。
研究者通过矩阵P来描述真菌和细菌群落的系统发育结构，该矩阵包含物种的组成，并通过R的PCPS包对它们的成对系统发育相似性进行模糊加权。在矩阵P中，每个OTU的每个样本值都随着相邻OTU之间的系统发育距离的减小而增大。用排序还原在样本水平上的矩阵P以表示系统发育结构。采用欧氏距离主坐标分析方法，提取代表主成分系统发育结构（PCPS1）的样本分数。该轴捕捉到谱系间最深的系统发育差异,可作为描述系统发育群落结构的单一变量用于进一步分析。研究者计算了每个真菌和细菌门作为每个分类单元对各自PCPS1的负荷的贡献（平均值±标准误差）。
通过测定真菌和细菌分泌的与C、N和P循环有关的7种水解酶的活性，评价了根际土壤（n=35）的群落功能。研究者测量了与C循环相关的β-葡萄糖苷酶（BG）、纤维二水解酶（CBH）、β-木糖酶（BXD）和β-葡萄糖醛酸酶（BGD）、活化P和几丁质酶（NAG）的酸性磷酸酶（AP）和L-亮氨酸氨基肽酶（LAP）的活性，它们都是参与氮迁移的酶。
使用R 3.1.1的vegan包测试了微生物群落系统发育结构的空间自相关的存在性。我们没有发现生态菌根真菌或细菌的空间自相关（所有地点的mantel相关，p>0.05），因此在进一步的统计分析中没有包含树木的地理坐标。研究者评估了植物基因型、当地环境和/或两者之间的相互作用是否对根相关微生物群落的系统发育结构有影响。为此，使用R的MCMCglmm包运行了贝叶斯广义线性混合模型（GLMM），在两个独立的模型中使用真菌PCPS1或细菌PCPS1作为因变量。因为考虑了共同花园中存在的所有三种基因型（即基因和表型不同的大西洋、地中海和非洲基因型），所以将植物的“基因型”作为一个固定因素。
因为需要分析局部效应，特别是是否存在“基因型”ד地点”的相互作用，因此我们将种植“地点”也当作一个固定因素。我们进一步将“块”作为随机因子引入到所有模型中。通过计算后验分布的95%可信区间，估计模型中各因素的统计显著性。为了检验是否存在显著的‘基因型’×位点’相互作用，研究者使用偏离信息标准对有或无相互作用的模型进行比较。“基因型”ד位点”相互作用在任何情况下都不显著，也没有进一步考虑。
为了检测整体功能反应，研究者进行了包括所有酶活性的主成分分析（PCA）。在上述两种不同的模型中，评估了植物‘基因型’、局部效应（‘位点’）或它们之间的相互作用是否解释了前两种酶活性。然后测试了微生物群落的系统发育结构是否预测了功能。为此，研究者使用前两个酶电位或每个酶活性作为因变量分别运行了单独的MCMCglmm。在所有模型中，将真菌PCPS1、细菌PCPS1和种植地作为固定因子，将块作为随机因子。对每个PCPS1和现场之间的相互作用进行上述测试，发现其不显著。
为了确保微生物群落系统发育结构或生态系统功能上的树木基因型差异不是树木地理起源和种植地点之间环境相似的结果，研究者将真菌和细菌PCPS1以及每个基因型的酶活性与种植地点和地理来源之间的环境距离进行了比较。
结果
共获得75872和133581个最终序列。序列分组共得到301个生态菌根（每个样本60±2个）和2650个细菌（每个样本501±14个）OTUs。生态菌根-OTU被分为子囊菌门（11%）和担子菌门（89%）。在26个已鉴定的真菌科中，Thelephoraceae, Atheliaceae, Inocybaceae, Russulaceae, Sebacinaceae, Cortinariaceae 和Bankeraceae最具代表性。我们鉴定了14个细菌门，包括变形菌细菌（33%）、放线菌（18.8%）、平纹杆菌（15.4%）、酸杆菌（13%）和拟杆菌（5.2%）。
通过构建系统发育加权群落（分类单元×样本）矩阵（矩阵P）来描述微生物群落的系统发育结构。矩阵P的值显示了生态菌根和细菌门对整个系统发育群落结构的不同贡献（图s3）。子囊菌表现出较高的矩阵P值，表明这些真菌与担子菌相比有与近亲共存的趋势。对于细菌来说，属于变形菌门、厚壁菌门、酸杆菌门和类糖化菌门的OTU表现出最高的矩阵P值，而类杆菌和平纹菌的OTU得分最低（图S3）。
对矩阵P进行多元分析，系统发育群落结构的第一主成分（PCPS1）分别解释了生态菌根和细菌群落总方差的50%和41%。真菌门对PCPS1的贡献显示担子菌在轴的负极上占优势，而子囊菌在正极上占优势（图1a，左图）。对于细菌，观察到蛋白细菌与PCPS1负相关，其他门与PCPS1正相关（图1b）。
种植地显著地解释了生态菌根和细菌群落的系统发育结构（图1），这种影响在植物基因型间相似。最有趣的是，植物基因型显著地解释了生态菌根和细菌群落的系统发育结构（图1）。种植地点对构建生态菌根群落的影响大约是植物基因型的2-3倍，而细菌群落的影响则相反（图1；右图）。
具体来说，研究者在地中海树木下发现了不同的真菌组合，其系统发育结构主要受优势担子菌的影响，与大西洋基因型相比，子囊菌数量较少的地方影响较大（图1a，右图）。非洲树木的真菌组合与其他任何一种植物基因型没有显著差异（图1a，右图）。地中海型细菌群落的系统发育结构与其他两种基因型有显著差异，并表现出单一的优势蛋白细菌门的显著影响（图1b，右图）。然而，大西洋和非洲基因型根际的细菌系统发育群落结构没有显著差异，这主要受其他13个门的影响，包括丰富的酸杆菌和放线菌以及其他不太常见的门。
根际土壤中的酶活性在不同植物基因型和地点表现出很大的变异性（图2）。PCA分组的前两个轴的所有酶活性分别占方差的30.9%和26.4%（图2）。大西洋基因型的酶谱与其他两种基因型的酶谱不同（图2），并且根据BG:（NAG+LAP）和BG:AP的比例，显示出更多的潜在分配给获取N和P的酶（表s7）。这三个种植点根据它们的酶谱图（图2）彼此明显分离，并且Cabañeros 和Espinoso之间BG:（NAG+LAP）和BG:AP的比率明显不同。为了解释这种变异性，研究者测试了生态菌根和细菌群落的系统发育结构的影响，这解释了介导C和N循环的几种酶的活性（表1）。然而，磷循环仅由种植地解释（表1）。真菌PCPS1对纤维二糖水解酶活性产生显著的负面影响，表明距离相关担子菌所占比例过高的样品也显示出较高的纤维素降解潜力（表1；图1a）。相反，真菌PCPS1与亮氨酸活性呈正相关（表1；图1a）。另一方面，细菌系统发育结构解释了β-葡萄糖醛酸酶和几丁质酶的活性（表1）。这两种酶与细菌PCPS1呈负相关，说明蛋白细菌对其活性有重要贡献。此外，种植地对几丁质酶有显著影响（表1）。
讨论
试验表明，海岸松的种内基因型差异显著地解释了根相关外生菌根和细菌群落的系统发育结构。这些微生物群落的系统发育结构的变化对生态系统的性能有着进一步的影响，这与营养循环相关的潜在酶活性有关（图3）。本研究为在野外条件下的植物-微生物群落相互作用提供了有价值的见解，从而克服了在实验室条件下进行的或专注于单一微生物群的研究的局限性。
当地环境背景是决定植物物种特性或基因型对微生物群落结构影响的主要因素。研究结果还表明，由于种植地是实验中的一个重要变异源，局部过程对生态菌根和根际细菌群落的系统发育结构产生了强烈的影响。尽管存在这种效应，研究者发现植物基因型始终决定着整个种植地的微生物群落。必须强调的是，树木基因型效应不是由于树木地理起源和种植地点之间的环境相似性造成的。
有趣的是，研究者观察到局部效应与生态菌根（而不是细菌）的系统发育结构特别相关。这些结果可归因于生态菌根真菌对环境因素（如pH值、水分利用率或土壤养分）的分散限制和/或粗粒响应，这些环境因素在不同地点之间存在显著差异。另一方面，种植地（与植物基因型相比）对根际细菌群落结构的较小影响可以解释为对精细尺度因子差异的优先响应。
无论环境条件如何，海岸松基因型都显著影响着根际生态菌根和细菌群落的系统发育结构。大西洋和地中海的基因型显示出系统发育上最明显的微生物群落。地中海树木根际的生态菌根系统发育组合以担子菌为主，与大西洋树木相比，担子菌往往与进化上的远缘真菌共存。这表明子囊菌的显著影响主要与近亲共同发生。尽管菌根共生体的特异性普遍较低，但根据其探索策略、养分动员能力以及是否受到宿主的青睐，分配给每一种真菌的菌丝体生物量的C值可能大不相同。即使是环境胁迫因子，伴随着植物光合活性的降低，也可以改变细胞外基质的群落，特别是通过提高子囊菌丰度而实现这一改变。作者认为植物基因型通过决定共生体（甚至在种内水平）的资源分配，可以选择具有不同竞争能力的真菌分支，影响生态菌根真菌的系统发生群落结构。
海岸松基因型也决定了根际细菌群落的系统发育组合。根际沉积物的浓度、组成和质量决定了根际细菌的丰富度和多样性。特别是根系分泌物对根际细菌结构和活性的影响，被认为是植物C分配策略的基因变异所致。此外，植物光合产物可以通过外生菌根转移到土壤细菌中。这项研究发现，与地中海型松树相关的细菌群落中，变形菌的比例过高，它们与邻居的系统发育距离较低。变形菌包括以不同顽固性的C源为食的共营养微生物，它们的竞争优势远远超过了相关的细菌谱系。这种能力导致它们在富含C的土壤环境中占据主导地位，它们往往与近亲共存。因此，结果表明，地中海高产基因型能够产生更多的光同化物和/或以根系分泌物的形式重新定向，促进这些竞争性细菌分支的增殖。
树状基因型所形成的生态菌根和细菌系统发育结构可以预测针对不同有机化合物的酶活性。在群落水平上，酶活性的相对产量应反映出与底物利用率和生长需求相关的最佳资源配置。研究者观察到较高的肽酶活性归因于生态菌根子囊菌在大西洋基因型根中的优势。在低矿质氮有效性的情况下，蛋白酶活性也有所提高。研究者先前的研究结果证实了这一点，即大西洋基因型与其他两种基因型相比，在土壤性质和土壤生物地球化学功能方面存在更大的差异。此外，在大西洋基因型下，生态菌根子囊菌的过度表达可能通过产生黑色素菌丝对N的保留进行反馈。
先前的研究已经证明，不稳定的C（如根系分泌物）输入土壤，会造成启动效应，高氮有效性会刺激纤维素降解酶。因此，高产地中海基因型导致产生半纤维素酶和几丁质酶的蛋白菌和具有更高纤维素分解活性的胞外基质担子菌中丰富的根际微生物群，提供更肥沃的营养环境和更多微生物转化的证据。与作者的研究结果类似，Uroz等人（2013）报道了森林树木的外生菌根圈明显富含能够水解几丁质的蛋白细菌菌株。细菌间几丁质酶的产生是生态相关的，因为除了致病性外，它们还参与了真菌坏死组织中氮的动员。另一方面，生态菌根真菌也能降解几丁质，但在真菌科之间具有相反的调节模式，这可以抵消研究者研究中在门水平上测量的影响。反过来，研究结果可能表明，不同功能群的微生物可以相互补充，对植物生长有积极的影响。
结论
除了决定土壤微生物群落系统发育结构的强大局部效应外，植物基因型（甚至在种内水平）在其根际微生物成员中也留下了系统发育特征。这些结果首次证明了植物基因型变异对根际真菌和细菌群落相互作用的影响是系统发育结构和调控C、N循环的基本步骤，并有潜在的固碳作用。这表明植物种内遗传变异在调节营养循环的微生物控制方面具有重要的生态学意义。鉴于土壤微生物在养分循环和气候反馈中的重要性，将植物种内多样性纳入预测气候变化情景下生态系统功能变化的模型中似乎至关重要。
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