【科研速报】寻踪丹尼索瓦人-白石崖溶洞遗址土壤沉积物古DNA分析

图1.白石崖洞外景

丹尼索瓦人，遗传特征研究深入，是新发现的一支古老型人类(1-4)，与曾广泛分布在欧洲的尼安德特人是姐妹群(5, 6)，对现代大洋洲、东亚、南亚和美洲原住人群有遗传贡献(2, 7, 8)，是国际广泛关注的研究热点。

此前，兰州大学和中科院青藏高原研究所带领的研究团队报道了发现于青藏高原东北部白石崖溶洞的夏河人下颌骨化石的研究成果，利用古蛋白分析方法鉴定其为丹尼索瓦人，利用铀系测年方法将其年龄确定为距今至少16万年。然而，因为夏河人化石鉴定为丹尼索瓦人主要依据古蛋白中的一个氨基酸变化，并且化石缺乏埋藏地层和共存考古遗存信息，因此，该化石尽管极大地推动了青藏高原史前人类活动和丹尼索瓦人的研究，但其所揭露的这支分布在青藏高原上的丹尼索瓦人的信息却也非常有限，比如对其时空分布、遗传特征和文化内涵等所知甚少。

为全面了解夏河人下颌骨所代表人群在青藏高原生活的情况，自2010年开始，由现中科院青藏高原研究所所长陈发虎院士带领的兰州大学环境考古团队既已在白石崖溶洞及其所在甘加盆地开展考古调查和研究工作。2018年，由团队骨干张东菊教授带领的以兰州大学研究生为主的环境考古团队，对白石崖溶洞遗址进行首次考古发掘，并邀请国内外多个研究团队进行多学科综合研究。

经过多年的努力，兰州大学主导的研究团队在白石崖溶洞的研究获得重大研究成果，发现白石崖溶洞遗址保存有丰富的中更新世和晚更新世古人类活动遗存，成功获取丹尼索瓦洞以外的首个丹尼索瓦人线粒体基因序列，揭示丹尼索瓦人在晚更新世长期生活在青藏高原。相关研究成果于北京时间2020年10月30日凌晨两点在国际顶级学术期刊Science正式在线。

研究团队的发掘和研究工作显示，该遗址保存有连续的旧石器文化层和丰富的旧石器考古遗存，包括大量的石制品和骨骼遗存。沉积物的多指标分析显示，地层堆积主要为原生堆积，考古遗存未经过明显扰动。洞穴沉积物一般来源和搬运较为复杂，准确测年较为困难。研究团队在第1-6层选择了14件动物骨骼AMS¹⁴C测年，发现第4-6层的骨骼已经超出¹⁴C测年上限。同时，在第2-10层采集了12个光释光样品。结合AMS¹⁴C和光释光测年结果，建立贝叶斯年龄模型，为遗址建立了距今~19-~3万年的可靠年龄框架。

图2.考古发掘现场

图3.土壤沉积物DNA样品现场取样

图4.在中科院古脊椎所古DNA实验室进行沉积物样品的制备过程

沉积物DNA分析是一种新兴的古DNA分析技术，考古遗址沉积物可追踪相关遗址DNA保存状况及可能存在的远古人类，弥补了人类化石一般可遇而不可求的缺憾，极大地扩大了研究对象，打开了研究旧石器考古遗址人群演化的新窗口。这项新技术的强大之处在白石崖溶洞遗址沉积物的古DNA分析研究中得到了印证。遗址发掘前，研究团队邀请中科院古脊椎动物与古人类研究所付巧妹研究员一起开展沉积物DNA分析研究，张东菊教授与付巧妹研究员一起制定了古DNA分析沉积物样品的采样计划，确保样品采集和运送过程中不会受到现代人类的污染。为了把目标DNA从海量环境微生物DNA中识别、分离出来，付巧妹研究员团队通过高效的古DNA捕获技术尝试钓取35个样品的242种哺乳动物和人类的线粒体DNA，并使远古人类的DNA得以富集。

这些古DNA如同一把钥匙，打开了通往数万年前的世界的大门。分析显示，沉积物中的动物古DNA，包括犀牛、鬣狗等灭绝动物，与遗址发现的动物骨骼遗存一致。这是迄今为止首次在夏河县区域发现它们的存在，拓宽了我们对这些灭绝动物栖息范围的认知。

图5.星号标示出的地层表示检测到古人类线粒体DNA。其他没有标出星号的地层表示该层未发现含有古DNA特征的人类线粒体DNA，相关的人类DNA来自当今现代人DNA的污染。

更激动人心的是，付巧妹研究员团队通过54个不同现代人、23个尼安德特人、4个丹尼索瓦人和一个40万年前古人类Sima个体的线粒体基因组，甄别出分属于现代人、尼安德特人及丹尼索瓦人等各自支系特有的突变，在此基础上，明确了白石崖洞的四个地层里有已灭绝的古人类——丹尼索瓦人——的线粒体DNA。通过分析，除了极少数样品，大部分地层取样都没有受到当今现代人DNA的污染，这显示出研究团队在发掘之前制定严格并完备的取样计划以避免污染的重要性。

图6.通过现代人、尼安德特人和丹尼索瓦人等各自支系特有的突变，对地层4中的所有DNA片段（A）和仅有古DNA降解片段（B）进行谱系。

图7.白石崖溶洞地层4和地层2沉积物样品（A）、地层4和地层3沉积物样品（B）、及地层4和地层7沉积物样品（C）中古人类线粒体DNA的系统发育树分析

此外，特有遗传突变等多种计算显示，土壤沉积物的样品存在多个个体的DNA，也就无法通过叶端定年(tip dating)计算相关样品的年代。因此，只能根据地层测年结果对样本年代进行推测。据估计，其中三个地层的丹尼索瓦人DNA主要出现于距今3-5万年（地层2和3）和距今6-7万年（地层4）前后。通过线粒体DNA系统发育树分析，这些地层（2，3，4）里的古人类DNA与来自俄罗斯阿尔泰山脉丹尼索瓦洞穴的晚期丹尼索瓦人（Denisova 3和Denisova 4）有最紧密的遗传联系。这也引出了一个引人遐思的问题：在3、4万年前，当现代人抵达青藏高原时，这些白石崖溶洞的丹尼索瓦人是不是也还活着呢？相反的，光释光测年约10万年前的地层中（地层7）的丹尼索瓦人线粒体DNA分析结果显示，他们在更早的时候就与晚期丹尼索瓦人分离开来了。这是首次在丹尼索瓦洞穴之外的地方发现丹尼索瓦人，是支撑丹尼索瓦人分布广泛的一个有力证据。以上结果在与古DNA领域泰斗——马普进化人类学研究所的Svante Pääbo教授团队讨论时得到了认可。

综合夏河下颌骨化石和白石崖溶洞的最新研究结果来看，丹尼索瓦人自倒数第二次冰期至末次冰期都生活在青藏高原，并且与阿尔泰山脉地区的晚期丹尼索瓦人有最紧密的遗传联系，进一步证实丹尼索瓦人曾广泛分布于欧亚大陆东侧。

白石崖溶洞的最新研究成果，为白石崖溶洞遗址的丹尼索瓦人活动提供了可靠的地层学、考古学、年代学和遗传学证据,为进一步理解丹尼索瓦人的时空分布、遗传特征、文化特征、环境适应等研究提供了重要科学依据，并且对重建青藏高原古人类活动历史和厘清东亚古人类演化历史具有重要意义。此项成果是在中国考古遗址沉积物中提取古人类DNA的第一个成功案例。

本文第一和通讯作者为兰州大学教授、中科院青藏高原研究所和青藏高原地球科学卓越创新中心特聘客座研究员张东菊，最后通讯作者为中科院古脊椎动物与古人类研究所付巧妹研究员，澳大利亚伍伦贡大学李波副教授和德国马普实验室进化人类学研究所Svante Pääbo教授为共同通讯作者。