Science子刊：中国学者研究出通过喝绿茶或能治疗糖尿病！

“碧螺壶中香扑面，绿茶盏内味如春”，中国的茶文化绵延不断上千年，国人爱品茶的习惯也早已根深蒂固，正所谓“宁可一日不食，不可一日无茶”。近日，国人的科学研究又为中国绿茶圈了一波粉。

10月24日，国际顶尖学术期刊《Science Translational Medicine》（IF 17.2）在线发表了华东师范大学叶海峰研究员团队题为A green tea-triggeredgenetic control system for treating diabetesin mice and monkeys的研究论文（封面文章），该研究创造性地开发出通过绿茶代谢物原儿茶酸（PCA）调控的基因表达装置，并率先在哺乳动物鼠和灵长类动物猴中成功实验，通过绿茶摄取在时空上调控治疗药物的释放，为人工定制化细胞疗法转化的临床应用提供了新的策略。这项研究也证明了基于细胞疗法的合成生物学在开发针对糖尿病进行远程调控方面的广泛潜力。

图0 通过喝茶来治疗1型和2型糖尿病。

绿茶包含丰富的茶多酚，能够降低患心血管疾病和糖尿病等其他疾病的风险。摄入绿茶后，茶儿茶素和酚酸迅速代谢为抗氧化剂原儿茶酸（PCA），它是绿茶中抗氧化剂多酚的主要代谢产物，具有代谢惰性且能迅速进入血液，在8小时之内能被肾脏清除，是特别合适于临床应用的触发分子。

随着社会发展，糖尿病人群体的日益扩大，但如何实现对患者血糖快速且精准的调控仍然是一个艰巨的挑战。

细胞疗法是治疗糖尿病的一种有前景的方法，研究者通过对细胞进行工程改造，开发出一种精细的控制系统，以响应绿茶中的代谢产物原儿茶酸（PCA）。研究发现口服摄取的原儿茶酸通过触发人和非人灵长类动物（1型和2型糖尿病）胰岛素或胰高血糖素的分泌可调节血糖。

PCA诱导基因开关的设计和验证

首先，作者基于源自链霉菌（Streptomyces coelicolor）的转录阻遏蛋白PcaV设计了PCA控制开关，并融合到真核表观遗传效应域上，该特异性结合域含有PcaV的合成启动子。

作者通过将遗传开关稳定整合到HEK-293细胞中，探索了使用PCA监测体内工程化的基于细胞的长期疗法的潜力（图1，E至K），发现HEK PCA-ON-SEAP细胞系显示出完全可逆和可调的诱导作用动力学（图1，F和G），以及出色的转化性能。然后作者通过微囊化以及在小鼠体内植入这些HEKPCA-ON-SEAP细胞，发现采用不同递送方式（腹膜内注射，口服水摄取或浓绿茶口服摄取），PCA均可以剂量依赖性方式控制报告蛋白SEAP的分泌（图1，I至K）。这些结果证明了在体内PCA可用作精确控制植入工程细胞的触发器。

图1 哺乳动物细胞和小鼠中PCA诱导开的设计和验证。

PCA诱导和gRNA介导的CRISPR-Cas9活性控制

完成了PCA ON开关概念的验证之后，作者将其用作控制模块以进行基因编辑控制和表观遗传重塑。作者设计了三个PCA诱导型CRISPR-Cas9系统用于指导gRNA依赖型人类细胞内源基因的抑制（PcaRi），激活（PcaRa）或缺失（PcaRdel）（图2）。

作者还将gRNA的表达策略用于PCA诱导型复合物（SAM：MS2-p65-HSF1）的协同激活及表达，并发现这能大大提高PcaRa的性能。此外，PCA 能以剂量依赖的方式激活转基因和内源基因（ASCL1，PDX1）的激活表达（图2，F至H）。

图2 基于PCA控制的基因组和表观基因组CRISPR-Cas9编辑装置。

作者进一步将PCA控制的CRISPR-Cas9系统重新用于基因编辑（PcaRdel），并使用基于移码增强型绿色荧光蛋白（fsEGFP）的测定法测试PcaRdel的内源基因缺失（图2I）。

作者发现针对人CCR5和EMX1基因的gRNA足以诱导indel形成（图2，K和L），这证明了对人类细胞中基因组序列靶向缺失受到高效且严格的调控，且基于CRISPR活性的紧密诱导可以动态控制内源基因的抑制、激活或缺失模式，因此作者的三种新型PCA诱导型CRISPR-Cas9系统可用于精确控制的基因组或表观基因组编辑。

工程化PCA和VA控制的小鼠生物计算型细胞植入物

作者将PCA ON系统与先前报道的基于VA的转基因控制系统相结合，使用五个逻辑门来实现各种操作，并将该生物计算机安装在细胞内并植入动物体内，其可以根据原儿茶酸和香草酸存在与否的指令执行准确的逻辑运算。

在成功验证了哺乳动物细胞中PCA和VA控制的可编程逻辑门生物计算机之后，作者接下来在小鼠中测试了它们的功能（图3）。为了模拟体内治疗性蛋白质的受控释放，作者用分泌性蛋白质SEAP代替了荧光报告基因d2EYFP，并植入了微囊化的程序化细胞以执行NIMPLY（图3，A和B）、“和”（图3C）、“或”（图3D）以及“或非”（图3E）。

作者以各种组合方式给小鼠施用PCA和VA，对小鼠血流中SEAP的定量验证了所有门类型的逻辑操作（图3）。与设想一致，只有在存在特定输入（PCA或VA）的情况下，两个NIMPLY电路中的SEAP表达才会显着增加（P=0.001或P<0.001，图3，A和B）。而且，在PCA和VA均存在的情况下，AND门的显示出高输出信号（图3C）。当既没有PCA也没有VA时，或门显示出低输出信号，而在有一个或两个输入存在时输出信号增加（图3D）。与“或”门相反，在没有PCA和VA的情况下，小鼠的“或非”门显示出较高的输出信号产生，而在存在任何一个或两个输入时，则显示出低输出信号（图3E）。

这些生物计算的结果表明，可以使用酚酸如PCA远程控制复杂的活体遗传程序。作者在原理验证实验中开发的模块化组件，可在未来用于更复杂的基于动物细胞的精密给药治疗工程中。

图3 小鼠中PCA和VA控制的可编程型生物计算机。

PCA调控的工程细胞用于小鼠的糖尿病治疗

在验证了PCA施用能够触发的小鼠在数周内的受控药物递送后，作者测试了PCA ON系统治疗实验性糖尿病的潜力。在PCA ON开关1.0 的基础上，作者设计了两种不同的血糖稳定细胞：一种允许PCA诱导表达SEAP和胰岛素，另一种则产生人胰高血糖素样肽1（shGLP-1）的变异体和SEAP。当将这些血糖稳定细胞分别植入1型（图4，B至D）和2型糖尿病（图4，E至I）的小鼠模型时，胰岛素被显着诱导（图4B）。但是，PCA ON系统的1.0版本不足以通过口服PCA给药产生治疗效果（图1J）。

图4 PCA ON-1.0开关控制的1型和2型糖尿病小鼠的治疗。

为了减少触发作者的感应系统所需的PCA量，并最终旨在基于口服PCA或绿茶进行口服治疗，作者大幅提高PCA ON开关的灵敏度。与最初的开关相比，PCA ON开关的增强版本2.0对PCA要敏感很多，尤其是在较低PCA浓度（5至80μM）下，并且增加了细胞内PCA浓度。

在PCA ON开关2.0 的基础上，作者接下来构建并选择了两个高敏感性和诱导型等基因细胞克隆，这些克隆允许PCA诱导胰岛素和SEAP以及shGLP-1和SEAP转基因的表达。PCA ON开关2.0显示出比PCA ON开关1.0 更大的转基因诱导700倍以上（图5，D和E）。

当微囊HEK将PCA-ON-2.0-shGLP-P2A-SEAP细胞植入小鼠体内，无论采用何种递送方式（腹膜内注射，口服摄入PCA或浓缩绿茶），PCA都可以以剂量依赖的方式控制转基因表达（图。 5，F到H）。这些结果表明，在哺乳动物中，PCA ON开关2.0对PCA更为敏感，并具有更好的转基因诱导效果。

图5 在哺乳动物细胞和小鼠中PCA ON开关（2.0增强版）的设计和验证。

为了证明抗糖尿病功效，在1 型糖尿病和2型糖尿病小鼠腹膜内植入微囊化的HEK PCA-ON-2.0-SEAP-P2A-mINS和PCA-ON-2.0-shGLP-P2A-SEAP细胞。在这两种疾病模型中，口服PCA或浓缩绿茶足以诱导的胰岛素（图6A）或shGLP-1（图6D）表达足以恢复的空腹血糖（图6，B和E）和葡萄糖耐量稳态（图6，C和F）。

图6 口服PCA或喝茶可实现小鼠基于PCA ON-2.0开关控制的1型和2型糖尿病治疗。

PCA调节的工程细胞用于非人类灵长类动物的糖尿病治疗

啮齿动物模型常常不能如实反映人类状况，而非人类灵长类动物（NHP）与人类的遗传、解剖学和生理学相似性更高，是更适合的实验疾病模型。因此，作者将微囊化的HEK PCA-ON-SEAP-P2A-mINS细胞植入食蟹猴，并测试了PCA ON开关1.0的适用性。

图7 PCA ON-1.0开关控制的1型糖尿病NHP的治疗。

接受口服PCA的猴子的胰岛素敏感性在2周内得到了改善（图8F）。此外，在1型和2型糖尿病猴子中，与炎症反应相关的血液生化指标包括白细胞计数，淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的炎症反应都没有增加），表明局部炎症反应可忽略不计。此外，血液生化测试显示治疗期间不存在器官损害。

为了确定作者的PCA ON开关2.0更加灵敏，并希望通过NHP模型中的PCA口服给药实现精细的糖尿病控制，作者进行了另外一系列的实验，并得出了类似的结果。

图8 PCA 口服PCA ON-2.0开关控制的2型糖尿病NHP的治疗。

结语

总的来说，作者开发出一种高敏感型工程细胞系统，该系统通过口服普通饮料（绿茶）来触发，以控制最普遍的代谢性疾病之一，这项研究证实了合成生物学理论的医学实用性，可用于对未来基于基因和细胞的精确医学应用进行治疗输出的动态远程控制。作者在本研究中展示的控制系统设备构成了高度灵活的控制平台。作者设想可以创造性地部署它，以解决生物学和生物医学中的多种遗传控制系统问题。

但是，目前的PCA诱导工程细胞仍存在局限性。通过转座子系统Sleeping Beauty将PCA ON开关稳定整合到基因组的过程中，由于随机整合，可能会发生不需要的插入诱变。因此，以后可以使用基因编辑工具（例如CRISPR）来实现将开关轻松持久地整合到人细胞中的目标基因组序列中，而无需进行插入诱变。其次，研究中采用的细胞系HEK-293虽然易于操作且非常适用于该系统，但对于临床转化来说，将系统整合至病人的细胞中会更加安全。最后，细胞植入体内采取的微胶囊包裹技术在延长细胞使用寿命上也需要改善。

原文链接：https://stm.sciencemag.org/content/11/515/eaav8826

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