大豆根际微生物群落的变化及其与根瘤菌共生效率的关系

Variation in rhizosphere microbial communities and its association with the symbiotic efficiency of rhizobia in soybean

The ISME Journal [IF:9.493]

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-020-0648-9

发表日期：2020-04-27

第一作者：Qin Han¹

通讯作者：Yang Bai(白洋)(ybai@genetics.ac.cn)², Wenfeng Chen(chenwf@cau.edu.cn)³, Xia Li(李霞)(xli@mail.hzau.edu.cn)¹

合作作者：Qun Ma, Yong Chen, Bing Tian, Lanxi Xu

主要单位：

¹华中农业大学农业微生物学国家重点实验室(State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, No. 1 Shizishan Road, Hongshan District, Wuhan 430070 Hubei,
China)

²中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室(State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Genetics and Developmental Biology, The Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

²中国农业大学农业生物技术国家重点实验室(State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences and Rhizobium Research Center, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

写在前面

关键字：中华根瘤菌，慢生根瘤菌，芽孢杆菌，根际微生物组，共生效率，盐碱条件

点评：大豆根际具有特定的微生物群落，但是尚未对这些微生物是否影响根瘤菌结瘤进行深入研究，该研究报道芽孢杆菌和根瘤菌之间相互作用关系以及芽孢杆菌对胁迫下根瘤菌-豆类共生结瘤的影响的研究。为了了解大豆植物、根瘤菌和土著微生物群之间的相互作用，作者研究了三种土壤类型(pH不同)中根际区域微生物群的组成和网络关系，鉴定了与根瘤菌结瘤相关的微生物，分离了候选菌株，并最终探讨了它们在根瘤结瘤中的作用。本研究的发现为土著微生物群在根瘤菌适应其环境和调节根瘤菌共生效率中的作用提供了第一个证据。总而言之，本研究发现表明，根际微生物群在根瘤菌-大豆共生和植物适应胁迫环境中具有重要的调节作用。

摘要

根瘤菌-豆类共生是植物-微生物共生的一种重要类型；但是，这种关联的建立很复杂，并可能受到许多因素的影响。大豆根际具有特定的微生物群落，但是尚未对这些微生物是否影响根瘤菌结瘤进行深入研究。在这里，我们分析了三种土壤类型中大豆根际区域微生物群的组成和相互关系。首先，我们发现在不同土壤中的大豆根际群落组成存在显着差异，并检查了根瘤菌与其他根际细菌之间的联系网络。其次，我们发现一些根际微生物与根瘤中的慢生根瘤菌和中华根瘤菌的组成有关。我们从碱性土壤中培养了278个候选芽孢杆菌分离株。最后，交互作用和结瘤试验表明蜡状芽孢杆菌组分别特异性地促进和抑制了中华根瘤菌和慢生根瘤菌的生长，并缓解了盐碱条件对中华根瘤菌的结瘤及其在瘤中定殖的影响。我们的发现证明了细菌菌群在塑造大豆根瘤菌-宿主相互作用中的关键作用，并为通过使用合成细菌群落提高这种共生体系的共生效率提供了框架。

背景

氮是所有生物的重要元素。它是通过固氮从二氮分子(N₂)中提取的，氮气占地球大气的78％。因此，固氮对于生命至关重要。固氮主要通过固氮细菌和古细菌在土壤中进行。在固氮细菌中，根瘤菌可作为腐生菌生活在土壤中，也可作为共生菌生活在其寄主豆科植物的根瘤中。在这些根瘤中，根瘤菌固定了大气中的氮以供宿主使用，而宿主则通过光合作用为根瘤菌提供碳。根瘤菌和豆科植物之间的这种共生是植物与微生物共生的一个极好的例子，不仅对豆科植物(例如大豆，鹰嘴豆，豌豆，普通豆和苜蓿)有益，而且对全球氮循环也有益。

根瘤菌-豆类共生的基础是一个复杂的过程，包括多个阶段，包括豆科植物根的根瘤菌侵染，根瘤发育，根瘤功能和根瘤衰老。虽然根瘤菌与豆科植物的相互作用已被广泛认识，但这种互惠共生关系具有高度的特异性和广泛的多样性。例如，豆科根瘤菌 bv. trifolii只能感染三叶草物种(Trifolium spp.)，而Sinorhizobium fredii NGR234表现出广泛的宿主范围，可以感染112个豆科属。根瘤菌对豆科宿主根细胞的选择性识别和侵染是成功建立共生的前提。对于给定的宿主，根瘤菌的成功侵染不仅取决于不同根瘤菌物种的竞争能力，还取决于根瘤菌应对各种波动环境因素(包括土壤特性和pH值)的能力。

在大豆中，中华根瘤菌(Ensifer)和慢生根瘤菌是两个主要的微共生类群，它们的结瘤能力不同。值得注意的是，这些根瘤菌在具有不同pH值的土壤中相互竞争。在酸性土壤中，大豆cv. Williams根瘤菌中的慢生根瘤菌菌株如 Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110占主导地位；相反地，在碱性土壤中，大豆根瘤中以中华根瘤菌菌株为主。有人提出，这些根瘤菌对不同pH值土壤的适应性是由慢生根瘤菌和中华根瘤菌介导的大豆根瘤的生物地理模式的基础。的确，中华根瘤菌种类在碱性盐渍土中占主导地位，而慢生根瘤菌在中性至酸性土壤中占主导地位。

土壤中还含有数十亿种的微生物，包括细菌和真菌。根瘤菌可能与其潜在宿主豆科植物的根际或土壤中的这些微生物竞争，从而建立共生关系。据报道，豆科植物，例如 L. japonicum, M. truncatula和大豆，在根际或根部的细菌装配的建立中起着至关重要的作用，而根瘤菌和豆类之间的共生直接影响着这两个区域中微生物的结构。构成常见结瘤信号通路或介导类黄酮和硝酸盐改变的基因(例如，Nod因子受体5，Nodule起始和Lotus组氨酸激酶1)功能的丧失会影响豆科植物根瘤菌的侵染，从而重塑根际微生物群落。植物与各种微生物建立密切的联系，形成复杂的群落，这些群落在宿主植物和环境之间会有所不同，这种平衡的改变可能会影响宿主的生长或导致疾病。大量证据表明，与根相关的微生物组可以影响植物与病原体相互作用的结果。因此，我们推测，根瘤菌-豆类共生体也可能受到生活在土壤中或栖息在植物生态位中的共生微生物的影响。此外，在大豆中，某些特定的官能团在根际中比在土体土壤中更具代表性，并涉及包括氮，铁，磷和钾的代谢在内的功能，但尚未确定它们是否影响宿主-根瘤菌的相互作用。

在这项研究中，为了了解大豆植物，根瘤菌和当地微生物群之间的相互作用，我们研究了三种土壤类型中根际区域微生物群的组成和网络关系。此外，我们鉴定了与根瘤菌结瘤相关的微生物，分离了候选菌株，并最终探讨了它们在根瘤结瘤中的作用。我们的发现为土著微生物群在根瘤菌适应其环境和调节根瘤菌共生效率中的作用提供了第一个证据。

结果

不同类型土壤中大豆根际区微生物组的组成和多样性

Composition and diversity of the soybean rhizocompartment microbiota in different types of soils

为了研究在不同土壤中生长的大豆微生物的组成和多样性，我们从武汉(湖北省)，四平(吉林省)和栾城县(河北省)三个主要大豆产区收集了三种不同类型的土壤，这些土壤的pH值分别为5.63(酸性)，7.2(中性)和8.23(碱性)。因此，我们按照Bulgarelli等人和Xiao等人的描述收集了根，根际，根瘤和土体土壤样品。通过PCR扩增16S rRNA基因的V5-V7区，并在Illumina MiSeq平台上测序。总共从48个样本中获得了1,797,926个高质量的非嵌合序列，每个样本的中值序列值为37,457(范围为30,032-44,608)。补充Fig. S2a中显示了基于OTU编号的分隔样品的稀疏曲线。测序数据被稀疏到在单个样品中观察到的最低数量的读长，并鉴定出3107个细菌OTU。补充表S5中显示了高通量测序结果的一般特征以及所有级别的分类单元编号。Good’s coverage对于观测到的OTU的覆盖率为98.65±0.08％(mean ± s.e.m.)，除了土体土壤和根际样品之间的差异外，其他隔室样品之间的Chao1指数值存在显着差异。

对于土体土壤，细菌群落组成在不同土壤中差异很大。酸性土壤中主要微生物菌群的相对丰度(包括酸杆菌门，变形菌门和绿弯菌门)显著高于中性(Ne)或碱性(Al)土壤，而中性(Ne)和碱性(Al)土壤中放线菌门、厚壁菌门和芽孢杆菌比酸性(Ac)土壤中的丰富(FDR矫正P<0.05，Kruskal–Wallis H检验)。三种土壤中的变形菌门和放线菌门的差异在根际样品中更大，但在根和根瘤样品中没有观察到。在科水平上，还观察到了不同土壤类型的根际取样部位细菌组成的差异，并且该趋势与门水平上的趋势一致。在前十个科中，土体土壤样品中的所有物种，根际样品中的六个物种，根样品中的五个物种以及根瘤样品中的只有两个物种显著不同，分别属于根瘤菌科和慢生根瘤菌科。阿尔法多样性分析(Shannon指数)表明，在三种土壤中，大豆根和根瘤微生物群落之间的差异在被测土壤中不如在根际或土体土壤样品中明显(图.1a)。Bray–Curtis距离的PCoA(β多样性)表明，三种土壤中的土体土壤(圆形)，根际(正方形)和根(三角形)微生物群表现出清晰的分离(图.1b)。对于根瘤取样部位，酸性(Ac)和中性(Ne)土壤样品聚集在一起，但与碱性(Al)土壤样品完全分开。基于Bray-Curtis和加权UniFrac距离的PERMANOVA证实，当在三种土壤中生长时，大豆三个根际取样部位中的微生物群落都具有显着差异(P<0.01)。

图 1 三种类型土壤中大豆根际区微生物组的α和β多样性

Alpha and beta-diversity of the soybean rhizocompartment microbiota in three types of soils

a 测量酸性土壤(Ac)，中性土壤(Ne)和碱性土壤(Al)中不同取样部分微生物群落的α-多样性(Shannon指数)。通过配对的Wilcoxon秩和检验进行统计分析，并以星号表示显著性，其中 P* <0.05。数据以中值±SDs(n=4)表示。

b 基于Bray–Curtis距离的PCoA表明，土壤类型是根际和根部细菌群落变异的主要来源。N=108。通过土壤类型的聚类显著性由Adonis确定(Pr(>F)= 0.001)。每个点对应于一个按土壤类型着色的不同样本，每个取样部位用不同的形状表示。

不同根际取样部位的微生物共现和相互作用网络

Microbial cooccurrence and interaction networks in the different rhizocompartments

不同微生物菌株之间的相互作用是种群结构和动力学的主要驱动因素之一，因为微生物可以相互合作或彼此排斥。因此，我们接下来使用Networkx软件分析不同隔间区域中的交互网络。根据属在三种不同土壤类型的样本中的发生模式，计算属之间的Spearman相关值。我们的结果显示，根际区隔微生物群内的节点连接性很高。在属水平前30种细菌的分析中，土体土壤中有202种相关性(图2a)，根际有184种相关性(图2b)，根部有90种相关性(图2c)，根瘤样本中有185个相关性(图2d)。这些结果表明，与土体土壤相比，根际和根部的相互作用网络相对简单。在根瘤中，细菌之间的相关性增加，而微生物网络的复杂性下降。除了慢生根瘤菌与中华根瘤菌(−0.847637)，Rhodococcus (−0.623598)，和 unclassified_f__Alcaligenaceae (−0.770069)呈负相关外，连通性表明所有其他属均呈正相关，这表明这些类群可以与大豆根瘤中的根瘤菌共现，并且不会彼此排斥。此外，我们发现在根际样品中也观察到了慢生根瘤菌和中华根瘤菌之间的负相关性(-0.70403)。此外，慢生根瘤菌和中华根瘤菌分别与另外14个和13个不同的根际属(正和负)相关(图2b)，这可能影响这两种类型的根瘤菌的结瘤。

图 2 不同隔间区域中的微生物相互作用网络

Microbial interaction networks in the different compartments

土体土壤(a)，根际(b)，根(c)和根瘤(d)中属水平(前30位)的优势菌群相互作用网络。节点的大小表示OTU的丰度，不同的颜色表示在门水平的相应物种分类分配。边颜色表示正(红色)和负(绿色)相关。边宽度表示相关值。仅显著相关的(r>0.6；P<0.05)被显示出来。

大豆根瘤中根瘤菌的组成取决于土壤条件

The composition of rhizobia in soybean nodules is soil condition-dependent

在天然酸性或中性土壤的根瘤群落中(图3a–I)，慢生根瘤菌是最丰富的菌属，约占总丰度的99.97％。相比之下，中华根瘤菌在来自碱性土壤的根瘤中占优势(98.56％)，而在来自酸性土壤(0.081％)或中性土壤的根瘤中的却占极少比例(0.007％)(图.3b–I)。为了进一步探讨土壤因素对根瘤中根瘤菌组成的影响，我们对种植的土壤进行了人工干预。首先，我们通过添加石灰(pH 8.2)来改变酸性或中性土壤的pH(图3a–II)；第二，我们将酸性或中性土壤与碱性土壤(1：1；w/w)混合(图3a–III)；再者，在种植植物之前，我们将土壤在80°C条件下加热20分钟(图3a–IV)。让灭菌的大豆种子在这些土壤中生长28天，并如上所述收集根际土壤(28个样品)和根瘤(28个样品)。这56个样品的扩增和测序产生了2,703,009个高质量序列(每个样本平均48,268且范围为30,585–95,823个序列)。补充图S7显示了基于OTU数量的来自两个取样区域样品的稀释曲线。使用与上述相同的标准将序列聚类到OTU中，产生2830个微生物OTU，两个取样部位的Chao1和Shannon指数显著不同(FDR矫正P <0.001，Wilcoxon秩和检验)。

图 3 土壤处理与根际和根瘤中的根瘤菌组成的关系

Relationship between soil treatment and composition of rhizobia in the rhizosphere and nodules

a 土壤处理的示意图。酸性土壤 (Ac)，中性土壤(Ne)，碱性土壤(Al)，酸性土壤加石灰(Ac8)，中性土壤加石灰(Ne8)，加热的酸性土壤(HAc)，中性土壤(HNe)，碱性土壤(HAl)，用50％(w/w)酸性土壤(Ac/Al)或中性土壤(Ne/Al)修饰的碱性土壤。

b 图a所示土壤中种植的植物根瘤中的慢生根瘤菌和中华根瘤菌的相对丰度。I，II，III和IV分别代表普通土壤，pH值变化，混合土壤和热处理的土壤。紫色代表慢生根瘤菌。蓝色代表中华根瘤菌。星号表明，中华根瘤菌的相对丰度要高于慢生根瘤菌。

改变酸性或中性土壤的pH值以创造碱性条件后，根瘤中中华根瘤菌的丰度没有增加(图.3b–II)。这表明，除了土壤的pH值外，土壤中的其他因素也可能影响根瘤中根瘤菌的组成。当大豆在酸性碱性混合土壤(pH 6.93)中生长时，中华根瘤菌的相对根瘤丰度(86.56％)超过了慢性根瘤菌，而在中性碱性混合土壤(pH 7.71)中，中华根瘤菌的根瘤丰度却没有显著变化(图.3b–III)。进一步的热处理实验表明，在热处理的中性土壤中，根瘤中中华根瘤菌的相对丰度显著增加(54.64％)。但是，在经过加热处理的酸性土壤中生长的大豆植株中并未发现这种变化(图. 3b–IV)。这些结果共同表明，种植土壤对根瘤中根瘤菌组成的影响是复杂的，并不仅仅取决于土壤pH。

根际微生物组与根瘤菌的结瘤有关

Rhizosphere microbiomes were associated with nodulation of rhizobia

为了确定根瘤中根瘤菌组成的变化是否与根际细菌有关，我们分析了十个根际样品的微生物群落组成，并进行了聚类分析。热图分析的层次聚类结果根据优势门将十个根际样品分为三个主要簇，这三个簇在门上具有不同的细菌组合(图. 4a)。这些聚类通过基于Bray–Curtis距离和PERMANOVA的PCoA确认(P <0.05)，并且在十种土壤处理中观察到明显的聚类。主变异轴(解释总变异的37.9%)将聚类3(Ac, Ac8, and HAc)和聚类2(HNe and HAl)同聚类1(Ne, Ne8, Al, Ac/Al, Ne/Al, HNe, and HAl)分开，而次变异轴(解释总变异量的20.6%)将聚类2与聚类3分开(图. 4b)。

图 4 根际微生物群落结构与中华根瘤菌和慢生根瘤菌的结瘤有关

The rhizosphere microbial community structure was associated with the nodulation of Bradyrhizobium and Sinorhizobium

a门水平不同根际样品的细菌微生物的组成和聚类。

b土壤中生长的大豆幼苗的根际微生物组基于Bray–Curtis距离的PCoA分析如图3a所示；n=40。聚类的显着性由Adonis(Pr(>F)=0.001)确定。酸性土壤(Ac)，中性土壤(Ne)，碱性土壤(Al)，酸性土壤加石灰(Ac8)和中性土壤加石灰(Ne8)，用50％(w/w)酸性土壤(Ac/Al)或中性土壤(Ne/Al)修饰的碱性土壤和加热的酸性土壤(HAc)，中性土壤(HNe)，碱性土壤(HAl)。

c线性判别分析(LDA)结合效应尺度的测量，确定了b中数据的显著丰富性。富集在I组(紫色)和II组(蓝色)的分类群分别用LDA分数表示。仅显示LDA值大于3.5(P <0.05)的分类群。

接下来，我们根据根瘤中根瘤菌的组成 (图. 3b)将这10种处理分为I组 (Al, Ac/Al, HNe, 和
HAl)和II组(Ne, Ne8, Ne/Al, Ac, HAc, and Ac8)，并利用线性判别分析效果尺度(LEfSe)算法。结果表明，八个和五个科(LDA log得分阈值>3.5和P<0.05)最有可能分别解释了I组和II组之间的差异。在第一组中，Comamonadaceae的LDA得分最高(5.16)，其次是Pseudomonadaceae (4.89)， Alicyclobacillaceae (4.09)， Paenibacillaceae (4.7)，Rhizobiaceae (3.99)，Bacillaceae (3.98)，和Microbacteriaceae (3.73)，其被确定为I组的主要关键科，可能与中华根瘤菌的结瘤有关。相比之下，第二组中的指示细菌科聚集在Micrococcaceae (4.29)，Intrasporangiaceae (3.90)，norank_oGaiellales (3.77)，norank_oSC_I_84 (3.68)，and norank_p__Saccharibacteria (3.52)，这可能与慢生根瘤菌的结瘤有关。

在体外芽孢杆菌对根瘤菌生长的不同作用

Differential effects of Bacillus on the growth of rhizobia in vitro

在上述指示的科中，Bacillaceae是植物-微生物相互作用中的有益微生物，已在许多植物根际中被检测到，并且因其具有植物抗病性和促进植物生长的特性而闻名。Bacillaceae(占第一组OTUs的4.30%)在碱性根际样品中含量很高，而Bacillus**与根际样品(图.2b)中的中华根瘤菌呈显著正相关(r=0.714537)，这一事实促使我们探索Bacillus在根瘤菌结瘤中的可能机制。为此，我们从经热处理的碱性土壤中分离出候选Bacillus菌株。首先，选择了278个候选Bacillus分离株，并在YMA培养基(0.7％琼脂)上检查了它们与S. fredii CCBAU45436的相互作用。结果表明，一组具有相似形态的分离株(〜12.6％)显着促进了S. fredii CCBAU45436的生长。其余测试菌株对CCBAU45436的生长几乎没有影响。通过基于16S rRNA的方法，三个具有明显促进作用的代表性分离株(B-9，B-11和B-13)被鉴定为蜡状芽孢杆菌组(属于OTU1511)。为了在物种水平上进一步鉴定这些菌株，我们通过Illumina Hiseq平台进行了基因组测序。根据它们的平均核苷酸同一性(ANI)值，将这三个菌株重新分类为Bacillus albus B-9(95.61% ANI to B. albus N35–10–2)，B. cereus B-11(97.98% ANI to B. cereus ATCC 14579)和B. albus B-13*(98.26% ANI to B. albus* N35–10–2)。

当将CCBAU45436和3个Bacillus菌株在YMA培养基上以不同距离(0.6或1.2 cm)共培养4天时，S. fredii CCBAU45436的菌落直径(1.14 cm)(距Bacillus)在0.6 cm处明显大于距离1.2 cm的菌落(0.91 cm)(图5a，n = 12，P <0.0001，非参数Mann-Whitney检验)。更有趣的是，当B. diazoefficiens USDA110和Bacillus在YMA培养基上共培养时，与Bacillus相邻的USDA110的生长受到明显抑制(图5b)，变成椭圆形(图5c)。未观察到Pseudomonas菌株(也从碱性土壤中分离)对CCBAU45436有明显的生长促进作用，对USDA110有明显的抑制作用。此外，Bacillus还刺激了γ射线灭菌的碱性土壤中的S. fredii CCBAU45436的生长，但抑制了B. diazoefficiens USDA110的生长。总体而言，这些结果表明*B. cereus组可以分别特异性地促进和抑制CCBAU45436和USDA110的生长，再次表明Bacillus*属与根瘤菌相互作用。

图 5 芽孢杆菌对根瘤菌生长和结瘤的影响

Effect of Bacillus on the growth and nodulation of rhizobia

a 在YMA平板上，将芽孢杆菌菌落接种在S. fredii CCBAU45436菌落旁边，距离为1.2 cm或0.6 cm。

b 将芽孢杆菌菌落接种在B. diazoefficiens USDA110菌落旁边，距离为1.2 cm或0.6 cm。

c B. diazoefficiens USDA110的反向菌落接种在 a 中的Bacillus B-9附近。结果代表具有相似结果的三个重复样品之一。比例尺代表2毫米。

d 在对照条件下，用水或芽孢杆菌处理的CCBAU45436或USDA110接种植物的根瘤数。

e 在盐碱条件下用H₂O或芽孢杆菌处理过的CCBAU45436或USDA110接种植物的根瘤数(25 mM NaHCO₃ +75 mM NaCl)；实验重复两次。统计学分析通过Mann-Whitney非参数检验进行，显著性用星号表示，其中*表示P<0.05。数据表示为中值±SD(n＝4)。

芽孢杆菌可缓解盐碱条件对温室中CCBAU45436结瘤表型的影响

Bacillus alleviates the effect of saline–alkali conditions on the nodulation phenotype of CCBAU45436 in the greenhouse

接下来，我们研究了芽孢杆菌对温室中CCBAU45436和USDA110结瘤能力的影响，并添加不同浓度的过碳酸钠和氯化钠到蛭石上，以模拟盐碱条件。在对照条件下(pH 7)，USDA110接种的大豆的根瘤数要多于CCBAU45436接种的植物，但差异不显著。随着pH(碳酸氢根离子浓度)的增加，接种根瘤菌的两种植物中的根瘤数均增加，但接种CCBAU45436的植物中的根瘤数比对照条件下的增加更为明显。pH值为8(25 mM NaHCO₃ + 75 mM NaCl)时，最大的结瘤数(165)与较小的尺寸和叶片萎黄有关。对于USDA110接种的植物，pH=8.5时(50mM NaHCO₃+50mM NaCl) ，结瘤数最多(128)，而且萎黄病的严重程度不及接种CCBAU45436的植物。

在pH 7(对照)条件下，芽孢杆菌处理不会显着影响接种CCBAU45436或USDA110的植物的根瘤数(图. 5d)；与之形成鲜明对比的是，芽孢杆菌处理(B-9和B-11)恢复了接种CCBAU45436的植株的根瘤表型(减少的根瘤数)，而芽孢杆菌在pH=8(25 mM NaHCO₃ + 75 mM NaCl)条件下不影响USDA110接种的植株的根瘤数或大小(图. 5e)。
总之，这些结果表明CCBAU45436-大豆共生体比USDA110-大豆共生体对pH更敏感，并且芽孢杆菌可以减轻pH对CCBAU45436-大豆共生的抑制作用。

芽孢杆菌影响中华根瘤菌在根瘤中的定殖效率

Bacillus affects colonization efficiency of Sinorhizobium in nodules

为了进一步研究芽孢杆菌对大豆根瘤中的慢生根瘤菌和中华根瘤菌定殖的作用，我们进行了根瘤菌混合接种实验。在盐碱溶液(pH 8)条件下，将三种慢生根瘤菌和三种中华根瘤菌菌株共接种到有或没有芽孢杆菌的大豆植株上(图. 6a)。中华根瘤菌和慢生根瘤菌分别对碱和酸条件有更强的抵抗力，这与以前的研究一致。接种后28天，根瘤中的中华根瘤菌或慢生根瘤菌的种群分别以mlr6601或nodC的基因拷贝表示，并使用属特异性引物通过qPCR进行定量。使用CCBAU45436和USDA110基因组DNA的系列稀释液获得各自的标准曲线。同样，在对照条件下，有无芽孢杆菌处理的根瘤中，中华根瘤菌或慢生根瘤菌(基因拷贝)的种群数量也没有显著差异(图. 6b)。盐碱处理后，根瘤中mlr6601(中华根瘤菌)的基因拷贝略有增加(0.003增加到3.617×10⁵)，但与芽孢杆菌共接种后，其显著增加(增加到13.252×10⁵)(图. 6b，c)。接种芽孢杆菌前后，nodC(慢生根瘤菌)的基因拷贝数也减少，但差异不显着(图. 6c)。此外，我们用特异引物（OPL-114F-lipo和OPL-114R-lipo）扩增了根瘤样品中芽孢杆菌的标记基因，未检测到条带(数据未显示)，表明接种的芽孢杆菌没有进入根瘤。总之，这些结果表明，芽孢杆菌可能以依赖于碱性条件的方式间接地促进了中华根瘤菌在根瘤中的定殖。

图 6 芽孢杆菌对根瘤中根瘤菌定殖的影响

Effect of Bacillus on the colonization of rhizobia in nodules

a 混合接种实验的示意图，显示了种植，接种和定量检测方法。将三天大的植物移植到对照或盐碱处理的蛭石中，然后用混合的根瘤菌或含芽孢杆菌的混合根瘤菌接种。28天后，提取根瘤中的类细菌DNA，通过qPCR定量两种根瘤菌的浓度，并重复两次实验。

b 在对照条件下，中华根瘤菌或慢生根瘤菌的种群数量。

c 在盐碱条件下，中华根瘤菌或慢生根瘤菌的种群数量。Mix-R表示六株根瘤菌。用非参数Mann-Whitney检验分析了Mix-R和Mix-R+Bacillus处理的qPCR结果(n=4，ns不显着； P*<0.05)。每个图的柱状图表示中位数，并在适当的位置列出数值以便于清晰显示。

讨论

成功的共生体受根瘤菌及其豆类宿主的共同调节；此外，给定宿主中根瘤菌的结瘤率是可变的，并且受环境因素和共生根瘤菌的影响。一个众所周知的例子是，在不同pH值的土壤种植的大豆中，中华根瘤菌和慢生根瘤菌的结瘤率存在很大差异；中华根瘤菌和慢生根瘤菌的pH耐受性差异可能解释了这些根瘤菌的地理分布模式。比较基因组分析显示，已知与碱盐适应有关的属特定基因可能有助于观察到大豆中的慢生根瘤菌和中华根瘤菌的根瘤形成的生物地理模式。在这里，我们发现大豆根际微生物群，特别是蜡状芽孢杆菌类，影响中华根瘤菌和慢生根瘤菌的生长，这可能影响这两种根瘤菌的结瘤。

先前的研究表明，豆类具有核心的根际微生物组，其组成取决于宿主的基因型。我们发现，在三种土壤中生长的大豆植物在根际比根部具有更大的微生物多样性(图1a)，这与大豆和苜蓿的结果相似。这些结果表明，根部的微生物群落比起根际或土壤中的更能适应波动的生长环境，并且豆科植物在进化过程中获得具有招募某些可能对其生长有益的微生物的能力。此外，我们发现根际室微生物，尤其在根际中存在明显的相关性，包括根瘤菌与其他根际类群之间的相互作用(图2b)，这与研究表明的在中国51个大豆田中的土体土壤和根际中的细菌子网络受土壤pH值的影响最大相一致。

根瘤是根瘤菌生长空间的器官，是共生固氮的场所。先前的研究表明，根瘤内生菌的组成是植物物种特有的；在苜蓿中，中华根瘤菌是最主要的根瘤菌，而大豆根瘤中，中华瘤菌和慢生根瘤菌是最丰富的属。我们发现在碱性土壤中中华根瘤菌是根瘤中的优势种，而在中性和酸性土壤中慢生根瘤菌是根瘤中的优势种(图3b)。这些结果与以前的报道一致，后者表明大豆根瘤菌群落表现出巨大的生物地理类型，这是由当地的气候和水生因素所塑造的(有效铁和土壤pH)。此外，我们发现根瘤中的根瘤菌组成也可能受其他根际微生物群的影响，例如芽孢杆菌科，其可能与中华根瘤菌和慢生根瘤菌的根瘤定殖有关(图.5a，b)。

芽孢杆菌科是众所周知的有益根际和内生细菌，在大豆微生物群的非根际亚群落中占主导地位。据报道有数种芽孢杆菌菌株影响大豆结瘤，但尚不清楚芽孢杆菌在大豆结瘤中的作用。有趣的是，我们的数据显示，从盐碱土壤中分离的蜡状芽孢杆菌组菌株能特异性促进CCBAU45436的生长，但会抑制USDA110的生长(图. 5a，b)，并且我们推测芽孢杆菌也可能影响根瘤菌在土壤中的分布。通过用碳酸氢钠和氯化钠模拟盐碱条件，我们发现随着pH的增加，即使结瘤很小，但接种CCBAU45436的植物中的结瘤数也会增加，这也可能部分解释了为什么中华根瘤菌在碱性土壤条件下占主导地位。同样，在低磷条件下，某些根瘤菌也可以诱导更多和较小的根瘤，因为它们对压力相对更敏感。在正常条件下，芽孢杆菌不会影响CCBAU45436或USDA110接种植物的根瘤数。然而，芽孢杆菌处理在盐碱条件下恢复了CCBAU45436接种大豆植株的根瘤缺陷(主要是根瘤数)(图5e)，并且也影响了中华根瘤菌在根瘤中的定殖(图.6)。众所周知，根相关的细菌可以减轻盐分和碱度胁迫对植物的不利影响，因此这些根部相关的细菌可能有益于豆类中那些胁迫敏感性根瘤菌的结瘤。合作和竞争的微生物相互作用是在不同的隔间中驱动复杂的微生物组合以实现植物适应性的重要的选择力。据我们所知，该研究是第一个报道芽孢杆菌和根瘤菌之间相互作用关系以及芽孢杆菌对胁迫下根瘤菌-豆类共生结瘤的影响的研究。这些相互作用是否能在根际发生，以及芽孢杆菌如何影响盐碱条件下的根瘤表型和根瘤菌定殖仍不可知。进一步研究芽孢杆菌和根瘤菌之间的这种特殊相互作用，将有助于我们破译芽孢杆菌在不同土壤条件下调节大豆根瘤中根瘤菌结瘤和定殖的分子机制。

总而言之，我们的发现表明，根际微生物群在根瘤菌-大豆共生和植物适应胁迫环境中具有重要的调节作用。这些发现为大豆结瘤根瘤菌在田间的分布提供了新的见解并且提供了胁迫条件下大豆或其他豆科植物促进根瘤菌形成根瘤的新方法。豆科植物的完整基因组及其微生物对应物应被视为是根瘤菌-豆科植物共生体的遗传基础和提高共生固氮效率的基因工程中的重要组成部分。

材料与方法

土壤类型和根瘤菌

Soil types and rhizobia

2016年秋季，从中国三个主要的大豆种植区收集了15 cm深度的实验土壤：湖北武汉(30°48′30N，114°36′E)，河北省栾城县(37°94′N，114°72′E);及黑龙江省四平市(43°51′N，124°81′E)。未用大豆耕种或用草和杂草覆盖的土壤储存在室温下的盒子中。在武汉市农业科学院检测中心对样品的理化性质进行了分析。样品分别代表三种类型的土壤：酸性(Ac)，碱性(Al)和中性(Ne)，并且土壤中的营养元素含量不同。在以下土壤条件下确定微生物的组成和多样性：(I)未经处理的天然土壤(Ac，Ne和Al)；(II)热处理过的土壤(在80°C下处理3次，每次20分钟；HAc，HNe和HAl)；(III)用50％(w/w)碱性土壤(Ac/Al和Ne/Al)改良的酸性或中性土壤；(IV)用石灰改良的酸性或中性土壤(最终pH 8.2)(图. 3a)。

使用了慢生根瘤菌属(B. diazoefficiens USDA110，B.elkanii USDA76和B.japonicum 15781)和中华根瘤菌属(S.fredii CCBAU45436，J18-31和HH103)的菌株。菌株USDA110，USDA76、15781，J18-3和CCBAU45436由中国农业大学提供；菌株HH103获自华中农业大学。所有菌株在胰蛋白胨酵母(TY)培养基上于28 °C下生长3-4天，离心(4500 rpm 10 min)沉淀，并重悬于蒸馏水中。

温室实验

Greenhouse experiments

用氯气灭菌的大豆(Glycine max cv.Williams 82)种子分别在装有上述土壤的盆(10×10cm)中生长。每个盆中播有六粒大豆种子，并将其长期置于温室中(16小时光照，20°C/28°C，夜/日)。5天后，将幼苗稀疏至3-4颗 /盆，然后根据需要用自来水浇灌植物。根据Bulgarelli和Xiao的描述，在28天时收集了土体土壤，根际，根和根瘤样品。未种植的土壤样品用作对照(土体土壤)。每个处理重复4次，每个重复3到4颗幼苗。

16S rRNA基因样品的制备，测序和分析

16S rRNA gene sample preparation, sequencing, and analysis

总共使用48个未处理的土壤样品(12个土体土壤，12个根际，12个根和12个根瘤样品)和56个处理土壤样品(28个根际和28个根瘤样品)进行测序。使用E.Z.N.A.^®(Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA, USA)土壤DNA试剂盒提取微生物DNA。使用引物799F和1193R扩增细菌16S rRNA基因的V5-V7高变区。PCR进行如下：95°C下3分钟；27个循环，循环条件为95°C下30S，55°C下30S，72°C下45S；最终72°C下10分钟。反应以一式三份的20-μL混合物进行，该混合物包含5×FastPfu缓冲液4μL，2.5μmMdNTP2μL，每种引物(5μM)0.8μL，FastPfu聚合酶0.4μL和10μng的模板DNA。产物从2％的琼脂糖凝胶中提取，使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)进行纯化，并根据制造商的方案使用QuantiFluor™-ST(Promega, Madison, WI, USA)进行定量。根据Majorbio Bio-Pharm Technology Co.Ltd(中国上海)的标准规程，将扩增子以等摩尔浓度合并，并在Illumina MiSeq平台(Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)上进行双端测序(2×300)。使用UPARSE以97％的相似性阈值聚类可操作分类单位(OTU)；使用UCHIME鉴定并除去嵌合体序列；使用RDP分类器算法比对到Silva(SSU123)16S rRNA数据库，以70％的置信度阈值分析了每个16S rRNA序列的物种分类。用Mothur软件计算Chao1和Shannon的alpha多样性指数。使用Networkx软件进行网络分析。只有Spearman相关系数为|r|>0.6(P <0.05)才被视为指示有效的互作事件。使用R包vegan(version 2.1)进行基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)。进行线性判别分析和效应尺度测量(LEfSe)分析，以LDA分数至少为3.5寻找两组之间的显著差异(P<0.05)的物种分类。

微生物的筛选与鉴定

Microbe isolation and identification

为了从碱性土壤中分离出假定的芽孢杆菌，将1g土壤重悬于无菌磷酸盐缓冲液中，在150 rpm转速下孵育30 min，然后将悬浮液在80 °C下热处理20 min，并螺旋接种于Luria-Bertani (LB) 培养基中。挑选，纯化每个菌落类型的代表，通过形态对其进行鉴定，并将其在-80°C下保存在含有20％甘油的LB培养基中，直至进一步使用。通过16S rRNA基因测序确认属水平上的分离株的物种分类。基因组测序方案是由上海Majorbio Biopharm Technology Co., Ltd (中国上海)使用Illumina HiSeq 2000系统执行的。使用基因组序列查询NCBI数据库以获得最近邻序列，并通过JSpeciesWS比较测序分离株的基因组距离。

互作试验

Interaction assay

将候选菌株接种在5ml的LB培养基中，并以180rpm的转速于28℃下孵育过夜。将细菌培养物的OD在600nm处调节至0.5。USDA110和CCBAU45436菌株在TY培养基上28°C下生长3-4天，在600nm下将培养物的OD读数分别调整为1.0和0.5。接下来，将每个候选菌株的分离株或1.5μL悬浮液点在YMA平板上距B. diazoefficiens USDA110 或 S. fredii CCBAU45436 1.2厘米或0.6厘米的位置。将平板在28°C下孵育4-6天。使用Leica显微镜(DFC495)捕获图像。每种测定进行四次重复。

结瘤试验

Nodulation assay

将经氯气灭菌的大豆种植在装有灭菌蛭石的盆(10×10×10cm)中，生长4天。将植物分别移植到新鲜蛭石上，分别加入和不加入25 mM NaHCO₃和75 mM NaCl。然后，将植物用20 mL B. diazoefficiens USDA110 或 S. fredii CCBAU45436 悬浮液(OD600 = 0.1)接种，并同时用30μmL无菌水(对照)或芽孢杆菌悬浮液(OD 600 = 0.5)处理。根据需要用弱氮营养液(pH 7)给植物浇水。接种和处理28天后，确定了每株植物的结瘤数。每种处理均包括两份幼苗的四份重复。在相同条件下重复两次实验。

为了进行定殖试验，使大豆植物在蛭石中在与上述相似的条件下生长。用20ml混合的根瘤菌混悬液(USDA110:USDA76:15781:CCBAU45436:J18–3: HH103=1:1:1:1:1:1, OD600=0.1)
共同接种植物，并用30ml的混合芽孢杆菌(3个菌株)混悬液处理(或不处理)(OD600=0.5)。根据需要用弱氮营养液(pH 7)给植物浇水。接种后第28天，收集瘤子，并按照Trabelsi的描述(进行了一些修改)，对瘤子中的慢生根瘤菌和中华根瘤菌进行了定量。简而言之，使用E.Z.N.A.土壤DNA试剂盒(Omega Bio-Tek Inc.，美国乔治亚州诺克罗斯)，从每种处理中提取500 mg类细菌的总DNA。用BioPhotometer D30(Eppendorf)检查每个DNA样品的总体质量和数量。使用Bio-Rad CFX Connect Real-Time (Bio-Rad, USA)在96孔板上进行所有定量PCR。属特异的引物组分别用于分析慢生根瘤菌和中华根瘤菌中的nodC和mlr6601基因。使用CCBAU45436或USDA110基因组DNA的系列稀释液获得标准曲线。从每个菌株的标准品得出的循环阈值线性回归系数计算出慢生根瘤菌和中华根瘤菌的数量，并调整为每微升类细菌DNA溶液的基因拷贝数。每种处理均包括两颗幼苗的四份重复。在相同条件下重复两次实验。

统计分析

Statistical analysis

图形表示是使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA)生成的。计算数据的平均值和标准偏差。Kruskal–Wallis H检验用于识别土壤类型之间门或科水平的显著差异物种。进行了配对的Wilcoxon秩和检验，以比较不同土壤类型的α多样性。进行了置换多元方差分析(PERMANOVA)，以测量效应大小和beta多样性的显着性差异。芽孢杆菌和H₂O处理或Mix-R和Mix-R+Bacillus 处理的比较是通过非参数Mann-Whitney检验(GraphPad Prism)进行的。

Reference

Qin Han,Qun Ma,Yong Chen,Bing Tian,Lanxi Xu,Yang Bai,Wenfeng Chen,Xia Li. Variation in rhizosphere microbial communities and its association with the symbiotic efficiency of rhizobia in soybean. ISME J (2020) https://doi.org/10.1038/s41396-020-0648-9

通讯作者简介

李霞教授团队主要以重要经济作物大豆为主要研究对象，运用分子遗传学、生理生化、细胞生物学、各种组学综合多种手段，系统地研究大豆和根瘤菌识别、根瘤的形态建成及固氮效率调控的遗传学和表观遗传学机制，旨在解析菌植互作和大豆共生固氮调控的分子机制，挖掘具有重要育种价值的基因和优异等位变异。此外，我们对非生物逆境下大豆共生固氮的适应机制非常感兴趣。本团队已经在大豆共生固氮效率表观调控机制和植物耐逆分子机制方面取得了多项创新性成果，近年来在Nature Communications、ISME J、Molecular Plant、Plant Cell、Plant Physiology、PLoS Genetics、New Phytologist、Plant Journal等国际主流杂志发表了一系列有重要影响力的论文。更多信息请见：http://cpst.hzau.edu.cn/info/1015/1637.htm

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