Mol Cell | 熊勇/陈斯迪合作揭示SARS-CoV-2抑制宿主翻译的机制
责编 | 兮
由新冠病毒SARS-CoV-2引起的COVID-19 新冠肺炎大流行， 给人类的医疗、经济、生活带了巨大的负面影响，全面快速地了解新冠病毒感染致病原理，开发安全有效的预防、治疗方法是当今世界各国面对的共同难题。然而病毒感染是一个复杂的过程，涉及病毒的多个组成部分，并且在活跃的病毒复制过程中，某些病毒蛋白通常在细胞中异常高表达【1,2】。因此，了解每种病毒蛋白对感染细胞的作用，对于阐明病毒的致病机理及新型治疗靶点的开发具有重要的指导作用。
2020年10月29日，来自美国耶鲁大学熊勇团队和陈斯迪团队合作在Molecular Cell 上发表了题为Nonstructural protein 1 of SARS-CoV-2 is a potent pathogenicity factor redirecting host protein synthesis machinery toward viral RNA的研究论文 。
在本项研究中，研究人员单独表达并测试了SARS-CoV2的28种相关结构蛋白（ORFs）的细胞效应【3】，发现在所有测试的ORFs中（ORFs具体信息可参考原文【3】），Nsp1对人肺上皮起源的H1299细胞的细胞活力显示出最强的抑制作用。
这与之前相关冠状病毒Nsp1蛋白研究结果一致，例如小鼠肝炎病毒（MHV）Nsp1是主要降低细胞基因表达的主要致病因素【4】，以及SARS-CoV Nsp1抑制干扰素（IFN）依赖的信号传导，对细胞周期有显着影响【5】。近期的研究表明，SARS-CoV-2 Nsp1可以关闭细胞中的mRNA翻译并抑制先天免疫基因【6】。研究人员将Nsp1表达引入H1299细胞，48小时后，通过流式细胞仪分析检测发现，H1299细胞中的Caspase 3表达水平显著升高，诱导H1299细胞的凋亡，最终导致细胞死亡。
此外，研究人员构建了Nsp1三种不同形式的突变体（truncated,R124S/K125E点突变，N128S/K129E点突变），发现每一种突变体都完全消除了Nsp1的细胞毒性作用，综合性地证实了Nsp1蛋白抑制细胞活力的表型。
在此基础上，研究人员对Nsp1过表达的H1299 细胞进行mRNA测序分析，差异表达分析发现Nsp1广泛而有效地诱导的基因表达程序的改变，显著性地下调了5,394个基因， 上调了3,868个基因（FDR调整的q值<0.01）。
研究人员对1245个最受Nsp1抑制的基因和464个最受Nsp1诱导的基因进行了DAVID聚类和生物过程（BP）分析发现，Nsp1抑制基因主要富集在核糖体蛋白功能和翻译相关簇，例如核糖核蛋白（RNP）（q = 6.30e-57），核糖体RNA加工（q = 2.03e-28）和翻译 (q = 3.93e-28) ，线粒体功能和代谢簇（q < 1e-15），细胞周期和细胞分裂（q < 1e-10）等。这与Nsp1降低细胞活力表型一致。
为了更加全面地分析了解Nsp1的作用机制，团队研究人员深入探究了Nsp1蛋白的结构特征，发现Nsp1蛋白与40S核糖体可直接结合，该复合物的cryo-EM结构显示，Nsp1蛋白C末端结构域主要包含两个α螺旋结构，并与核糖体蛋白uS3, uS5，以及rRNA螺旋h18通过电荷相互作用以及疏水相互作用紧密结合，插入40S核糖体的mRNA通道中并阻断mRNA的进入，进而抑制宿主蛋白的表达。
Nsp1蛋白N末端结构域结合在40S核糖体头部结构域，覆盖uS3蛋白的大部分溶剂侧表面，其中包含一段保守的GXXG序列。通过体外结合实验可知，Nsp1蛋白竞争性抑制eIF3j蛋白与40S核糖体的结合，而eIF3j蛋白在正常的蛋白翻译起始过程中可以加强eIF3复合物的结合，使得翻译过程顺利进行。蟋蟀麻痹病毒（cricket paralysis virus, CrPV）的内部核糖体进入位点（IRES）序列可不依赖于宿主细胞的翻译起始因子，独自引导完成目的蛋白的翻译表达，该序列被广泛应用于翻译过程相关研究的实验中。已有研究表明，Nsp1蛋白可抑制CrPV病毒的IRES序列引导的蛋白表达。研究人员发现，Nsp1蛋白并不阻断该IRES序列与40S核糖体的结合。Nsp1蛋白、IRES序列mRNA以及40S核糖体的三元复合物的cryo-EM结构显示，由于Nsp1蛋白的C末端结构域阻塞了40S核糖体的mRNA通道，CrPV病毒IRES引导的mRNA无法进入通道中。通过结构比对发现，Nsp1蛋白与40S核糖体结合后，使得40S核糖体处于“闭合”状态，并限制了其头部结构域的转动，使得IRES序列mRNA结合后核糖体头部结构域无法转动至所需位置。在Nsp1蛋白与40S核糖体结合后，CrPV病毒IRES序列仍可与40S核糖体结合，但由于核糖体头部无法正常转动，以及mRNA无法进入通道等原因，无法正常形成具有生理功能的48S翻译起始复合物。
总之，该研究结果表明Nsp1通过插入40S的mRNA输入通道来抑制细胞但非病毒的蛋白合成，阐释了SARS-CoV-2抑制宿主翻译的机制，进一步解释了SARS-CoV-2的主要致病因素的影响，对未来新型抗新冠肺炎药物的开发具有指导作用。
该项研究由美国耶鲁大学熊勇实验团队和陈斯迪实验团队合作完成，熊勇教授，陈斯迪教授，和熊勇团队的Ivan B Lomakin研究员为该论文的共同通讯作者，耶鲁大学熊勇课题组的博士后袁帅和陈斯迪课题组的博士后彭磊为论文共同第一作者。
参考文献
2. Yoshimoto, F.K. (2020). The Proteins of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS CoV-2 or n-COV19), the Cause of COVID-19. Protein J 39, 198-216.
3. Gordon, D.E., Jang, G.M., Bouhaddou, M., Xu, J., Obernier, K., White, K.M., O'Meara, M.J., Rezelj, V.V., Guo, J.Z., Swaney, D.L., et al. (2020). A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature 583, 459-468.
4. Zust, R., Cervantes-Barragan, L., Kuri, T., Blakqori, G., Weber, F., Ludewig, B., and Thiel, V. (2007). Coronavirus non-structural protein 1 is a major pathogenicity factor: Implications for the rational design of coronavirus vaccines. Plos Pathog 3, 1062-1072.
5. Wathelet, M.G., Orr, M., Frieman, M.B., and Baric, R.S. (2007). Severe acute respiratory syndrome coronavirus evades antiviral signaling: role of nsp1 and rational design of an attenuated strain. J Virol 81, 11620-11633.
6. Thoms, M., Buschauer, R., Ameismeier, M., Koepke, L., Denk, T., Hirschenberger, M., Kratzat, H., Hayn, M., Mackens-Kiani, T., Cheng, J., et al. (2020b). Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science.