BT：关键胞外酶触发了细菌群落演替偶联的高效堆肥
关键胞外酶触发了细菌群落演替偶联的高效堆肥
Key extracellular enzymes triggered high-efficiency composting associated with bacterial community succession
Bioresource Technology [IF:7.539]
DOI: https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.121576
发表日期：2019-05-29
第一作者：Cece Qiao(乔策策)a,b
通讯作者：Rong Li(李荣)(lirong@njau.edu.cn )a
合作作者：C. Ryan Penton, Chao Liu(刘超), Zongzhuan Shen(沈宗专),Yannan Ou(欧燕楠), Zhengyang Liu(刘正洋), Xu Xu(徐谞), Qirong Shen(沈其荣)
主要单位：
a南京农业大学江苏省固体有机废弃物利用重点实验室(Jiangsu Provincial Key Lab of Solid Organic Waste Utilization, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Solid Organic Wastes, Educational Ministry Engineering Center of Resource-saving Fertilizers, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, PR China)
b美国亚利桑那州立大学生物设计研究所(College of Integrative Sciences and Arts, Center for Fundamental and Applied Microbiomics, The Biodesign Institute, Arizona State University, Mesa, AZ, USA)
写在前面
分享标题：胞外酶-化腐朽为神奇的催化剂
关键字：C/N、细菌群落、关键菌群、酶活、堆肥效率
点评：堆肥是一个极其复杂的物理化学变化过程，其包含着微生物群落的演替与复杂有机成分的降解，本文通过在不同初始C/N的堆肥堆中监测堆肥过程中（升温期，高温期，腐熟期）关键细菌群和胞外酶的演替过程以及有机物的转化，详细阐明了特定细菌群驱动的高效堆肥的特性和机理，确定了最佳C/N的范围及促进高效堆肥的潜在的关键微生物种类。作者对堆肥整个过程的每个时期都进行了详实的解读，通读本文能使我们对整个堆肥工艺有更深入的了解。
摘要
关键细菌军团在堆肥过程中扮演者重要角色。为了阐明特定细菌群驱动的高效堆肥的特性和机理，我们在不同初始C/N的堆肥堆中监测堆肥过程中产生的关键细菌群和胞外酶的演替过程。结果表明25和35的C/N能通过提高温度、提高萌发指数、促进纤维素和半纤维素的降解、提高纤维素酶和脱氢酶活性等来提高堆肥效率。纤维素酶和β-葡糖苷酶、纤维素酶和蛋白酶、纤维素酶和β-葡糖苷酶分别在堆肥的升温期、高温期、腐熟期与细菌群落组成显著相关。潜在的与较高堆肥效率有关的关键类群，如野野村菌属、德库菌属、纤维菌属、枝芽孢菌属、梭菌属和无色杆菌属，与胞外酶活性显著正相关，表明这些类群对堆肥腐熟度有重要贡献。
背景
人类目前面临着双重挑战，一方面既要确保粮食产量，另一方面又要尽量减少集约化农业对环境造成的重大影响，而造成集约化农业的部分原因是化肥的过度使用。同时，未经处理的有机废弃物数量的增加既是环境污染的一个潜在来源，也会对人类健康造成危害。为了解决这些问题，堆肥已成为处理有机废弃物以及长期改善土壤肥力和生产力的一种越来越有吸引力的方法。堆肥是指固体有机基质在高温条件下的生物降解过程，在此过程中病原体和杂草种子被消灭，高度不均匀的有机质转化为成熟的腐殖质。
在堆肥过程中，有机基质的生物转化是微生物群落在升温、高温、腐熟阶段活动的结果。微生物群落在堆肥的三个阶段中经历了组成和功能上的演替。堆肥开始于一个中等温度的阶段，其间嗜温微生物分解容易降解的可溶性化合物。然后这个群落通常会被嗜热微生物所取代，再之后随着肥堆在腐熟阶段的冷却，嗜温微生物又会复苏。细菌凭借其分解和矿化有机物的能力，在堆肥过程中扮演着不同的角色。某些细菌群的存在可以作为指示分解过程的阶段和质量的一个指标。例如，放线菌可以在中性和碱性的pH条件下及中温和高温(50-60℃)条件下生存，并能够降解木质纤维素等复杂的底物。丛毛单胞菌属（Comamonas）是变形菌门的一个属，具有代谢有机化合物的能力，据报道在升温期大量存在，但在腐熟期未检测到。因此，了解堆肥过程中细菌群落组成和功能的变化有助于控制或预测整个堆肥过程的效率。
微生物降解有机废弃物主要是通过水解胞外酶的活性来实现的。由此产生的水溶性化合物来支持微生物生长，以确保降解过程的持续性。这种有机物的生物转化需要多种酶的共同作用，如脱氢酶，纤维素酶,β-糖苷酶和蛋白酶等。脱氢酶由于其在呼吸链中的作用，被认为是生物活性的一般指标。因此，脱氢酶活性的变化可以用来监测堆肥状态，并提供有关堆肥成熟度的情况。纤维素酶，β-糖苷酶和蛋白酶分别与纤维素、糖苷的降解及源于蛋白质的N的矿化有关。因此，对这些酶活性的监测，以及对堆肥过程中细菌群落演替的理解，将使我们程进一步的了解有机废弃物的生物降解过程。
温度、曝气、pH、C/N和颗粒大小等因素都会影响堆肥的效率和产生有机物的质量。其中，初始基质C/N为关键因素，堆肥初始最佳C/N为25 ~ 30。较低的C/N会导致可溶性碱性盐的释放，不利于植物的生长。较高的C/N例导致氮的供应不足以支持微生物的最佳生长，从而导致分解速度减慢。虽然我们对底物C/N的广泛影响已经比较清楚，但是其在堆肥过程中对细菌群落演替和胞外酶活性的影响仍未得到充分的研究。为了了解堆肥过程中细菌群落对不同碳氮比的反应，我们使用了三种对比鲜明的原始材料:牛粪、蘑菇渣和锯末。假设在堆肥过程中，细菌群落的演替是由理化性质和胞外酶对基质的转化共同驱动的。本研究的总体目标是:1)研究堆肥阶段和C/N比梯度是如何影响细菌群落演替的;2)揭示堆肥过程中有机物转化的潜在机制;3)确定高效堆肥的关键微生物种类。
3 结果与讨论
3.1 理化参数
Physicochemical parameters
温度分布遵循好氧堆肥过程的典型演变，包括升温、高温和腐熟阶段(Fig. 1)。第5天，堆2和堆3分别以最高温度67.5℃和66.0℃时迅速进入高温阶段而C/N低的堆3处理在第16天达到58.5°C的最大值。堆2和堆3在55.0℃以上的高温阶段比堆1
持续的天数多。这是由于2号堆和3号堆的活性堆肥具有更理想的C/N，从而具有更高的生物降解性。统计分析表明，2号堆(P < 0.01)和3号堆(P < 0.01)的堆温明显高于1号堆，但2号堆和3号堆的堆温无差异(P = 0.146)。较高的温度支持更高的堆肥效率，以消灭寄生虫和病原体。
不同堆的pH值在分解过程中呈现先增大后减小的趋势 (Fig. 2)。3个处理堆中的发芽指数(GI)都呈上升趋势，直至腐熟期。堆肥结束时，较高C/N比的堆2(95.09%)和堆3(90.67%)比堆1(79.60%)具有更高的GI值。表明低C/N比的堆肥具有较高的植物毒性。总的来说，C/N在堆肥过程中趋于下降，这与之前使用牛粪和污水污泥的报道一致。堆肥以最终以C/N< 20达到腐熟期。综上所述，这些结果表明，为了使C/N接近35而调整原料是活性堆肥的最佳选择。Petric等人之前的研究结果也支持了这一观点，他们建议最有效的活性堆肥的初始堆肥C/N在25到40之间，甚至高达50。
C/N低的堆1和2中的木质素含量随时间推移略有增加，而堆3中木质素含量则呈相反趋势。堆肥结束时，1、2和3堆中的纤维素分别减少了78.9%、64.6%和61.6%，半纤维素分别减少了44.2%、34.0%和30.6%。考虑到堆肥材料及其固有成分的多样性，以往关于堆肥的研究结果与木质纤维素化合物的初始含量之间存在很大的差异。我们的结果表明，木质素的含量在堆肥初期略有增加，这与之前的结果一致。这可能是由于木质素部分的生物降解率相对较低，而其他纤维素成分的降解效率较高。在目前的研究中，纤维素在高温阶段快速降解，除了在早期的高温期外，半纤维素主要从堆肥开始到第25天发生转化。可溶性有机碳是微生物生长和活动的主要碳源和能量来源之一。考虑到纤维素降解在堆肥过程中提供可溶性碳的重要性，2号堆和3号堆可以有效地加速纤维素和半纤维素的降解，从而加速堆肥的腐熟进程。
图 1 堆肥过程中温度的变化
Variations of temperature during the composting process.
x轴底部的箭头表示采样的时间点。堆1、堆2和堆3的数值是四次测定的平均值，同时进行一次环境温度测量。
Fig. 1. Variations of temperature during the composting process. Arrows at the bottom of x-axis represent the time points at which samples are taken. Values are the means of four determinations in piles 1, 2 and 3 with one ambient temperature measurement
图 2 堆肥过程中所选择的物理化学参数的变化
Changes in selected physicochemical parameters during the composting process
在整个过程中一些理化性质变化：A: pH; B: 发芽指数(GI);C: C / N;D: 木质素含量;E: 纤维素含量;F: 半纤维素含量。
Fig. 2. Changes in selected physicochemical parameters during the composting process. A: pH; B: Germination index (GI); C: C/N ratio; D: Lignin content; E: Cellulose content; F: Hemicellulose content.
3.2 酶活
Enzyme activities
堆肥处理(P < 0.001)和所处的阶段(P < 0.001)对脱氢酶活性有显著影响，但它们之间没有相互作用(Table 2)。在堆2的高温期能观察到较高的活性(P < 0.001)。由于脱氢酶活性已被证明与微生物活性有关，堆2和堆3中较高的活性似乎与微生物活性的增加有关，从而提高堆肥效率。β-糖苷酶的活性取决于易于代谢的底物的存在，尤其是水溶性碳，因此,在升温阶段和堆2中此类化合物更高的可用性预计与更高的β-糖苷酶相关。总的来说，纤维素酶活性受堆肥处理和阶段及其相互作用的显著影响。升温阶段纤维素酶活性较低可能是由于分解纤维素的微生物生长缓慢所致。高温期纤维素酶活性的增加可能是有机物质进一步降解的结果。蛋白酶被认为是有机物质降解的指标，特别是作为碳源和能源的蛋白质底物。因此，在含有高浓度聚合大分子的堆肥过程中，有望发现较高的蛋白酶活性。总之，蛋白酶活性在整个堆肥过程中下降。在初始混合物中高浓度的可降解有机化合物可能刺激了微生物的生长和蛋白酶的活性，随着有效底物的减少，酶活性也随之降低。与其他酶类似，堆肥的处理和堆肥的阶段对蛋白酶活性均有显著的影响(P < 0.001)。
表 2 堆肥处理、堆肥阶段及其相互作用对堆肥过程中酶活性的影响
Effects of composting treatment, composting phase and their interaction on the enzymatic activities during the composting process
数值为平均值±标准差(n = 42)。NS:无统计学意义(P > 0.05)。
Values are mean ± standard deviation (n = 42). NS: not significant (P > 0.05).
3.3 细菌群落演替
Bacterial community succession
采用扩增子测序对126份样品进行细菌群落分析，研究堆肥处理和阶段对细菌群落的影响。关于细菌丰富度(Chao 1)和Shannon多样性的详细信息可在补充信息中获得。
PCoA被用来评估在每个处理堆肥过程中细菌群落组成的相似性(Fig. 3)。在堆肥初期，虽然三种堆肥处理的细菌群落组成有显著差异 (PERMANOVA,
pseudo-F = 4.038, P < 0.001; ANOSIM, P < 0.001) ，但它们之间的相似性要大于其他阶段。堆肥阶段(PERMANOVA, pseudo-F = 4.03, P < 0.001; ANOSIM, P < 0.001)和高温(PERMANOVA, pseudoF = 8.28, P < 0.001; ANOSIM, P < 0.001)及腐熟阶段(PERMANOVA, pseudo-F = 12.89, P < 0.001; ANOSIM, P < 0.001)的处理细菌群落有显著差异。具体来说，1号堆和2号堆的升温期细菌群落相似，而2号堆和3号堆在堆肥后期的细菌群落是相似的，说明在堆2中存在过渡细菌群落。先前的研究表明，堆肥过程中细菌群落组成的变化是由每一阶段环境条件和基质组成的变化所驱动的。根据这一概念，我们的结果表明，营养有效性随着堆肥阶段的不同而异，这可能会影响细菌的生长，因此这似乎是最具影响力的决定细菌群落组成的因素。在我们的堆肥系统中，次要的驱动因素是C/N，这在以前被认为是奶牛粪便中的驱动因素。容易获得的物质首先被分解，与高碳氮比的处理相比，最初的低碳氮比处理预期会导致相对较少的可用的碳质材料，因此从长期来看，对微生物生长来说是质量较差的基质。在堆2和堆3的高温和腐熟阶段，以木屑形式添加C可获得更高的分解速率，从而使活性堆肥获得更合适的C/N。由于分解是由多样的微生物群驱动的，因此有人认为20-40:1的初始碳氮比是活性堆肥的理想比例。因此，C/N比例的调整有望影响细菌群落的组成，从而达到较高的堆肥效率。
图 3 三种处理在堆肥过程中各发育时间点(阶段)的细菌群落结构
Bacterial community structure in the three treatments during the composting process at each developmental time point (phase)
PCoA排序分析并使用PERMANOVA和ANOSIM检测差异，堆肥处理和堆肥阶段与群落组成显著相关(** P* < 0.001),即堆1、堆2、堆3，采样日(0日、1日、5日、16日、25日、 39日)。
Fig. 3. Bacterial community structure in the three
treatments during the composting process at each
developmental time point (phase). PCoA ordinations
by PERMANOVA and ANOSIM showing significant
associations of community composition with composting treatment and phase (*P < 0.001), that is,
piles 1, 2 and 3, and day of sampling (day-0, 1, 5, 16,
25 and 39).
3.4 将细菌群落与环境参数和酶活性联系起来
Linking the bacterial community with environmental parameter and enzymatic activity
采用RDA分析测定三个不同堆肥阶段的主要理化参数、酶活性和细菌群落组成之间的关系(Fig. 4)。冗余分析中的Monte
Carlo 置换检验 表明，所选择的理化参数分别与升温阶段(Pseudo-F = 3.77, P < 0.001)、高温阶段(Pseudo-F = 3.21,
P < 0.001)、腐熟阶段(Pseudo-F = 4.08, P < 0.001)显著相关。
第一和第二RDA组分(RDA1和RDA2)分别解释了堆肥的升温、高温、腐熟阶段细菌群落组成总变异量的70.1%、59.7%和80.0%。正如相对紧密的聚类解释的那样，在升温阶段，细菌群落是根据堆肥时间沿第一RDA组分进行分组的。温度、C/N、纤维素酶活性与细菌群落组成的相关性最大。2号堆和3号堆的群落主要相关于较高的蛋白酶和纤维素酶活以及温度和堆肥C/N。在腐熟阶段,第一RDA组分将各堆区分开来并解释了群落总变异的54.3%,且最相关与β-糖苷酶和纤维素酶的活性。在堆肥过程中，温度和C/N被证实是影响细菌群落组成的最主要因素，这与Onwosi等人的结果相似。温度的影响可能是归因于对堆肥微生物菌群细菌群落生理和底物的生物可利用性的影响。如前所述，具有易于代谢底物的高可用性特点的堆肥阶段应该与更高的酶活性相关。在整个堆肥过程中，纤维素酶活性与细菌群落组成显著相关，这表明在整个堆肥过程中纤维素物质是可用的。相比之下,在升温和腐熟阶段细菌群落组成与β-葡糖苷酶显著相关。这可能是由于源自纤维素和半纤维素分解活动的碳化合物的出现。
图 4 RDA分析了三种处理的升温、高温、腐熟阶段的细菌群落组成
RDA analyses of the bacterial community composition within the three treatments from different phases: mesophilic, thermophilic and mature phases
对不同处理细菌群落进行RDA分析表明：环境参数、酶活性和细菌群落组成之间的关系。
Fig. 4. RDA analyses of the bacterial community composition within the three treatments from different phases: mesophilic, thermophilic and mature phases. RDA
illustrates the relationships among the environmental parameters, enzymatic activities, and bacterial community composition.
3.5 可能与功能酶的表达和活性有关的关键类群
The key taxa potentially linked to expression and activity of functional enzymes
三个处理中，LDA值高于3.5的属水平指示菌群以及候选菌属的相对丰度在补充信息中可见。在这些丰富的属中，Nonomuraea flexuosa 具有一种木聚糖酶，由于纤维素和木聚糖的密切相互作用，它可以水解木聚糖和木质纤维素。据报道，Cellulosimicrobium cellulans可能产生纤维素酶。Virgibacillus sp.是一个能分泌endo-β-1,3-glucanases的放射菌。对于高温阶段，枝芽胞杆菌属是生产蛋白酶的最佳菌株。嗜热纤维梭菌的纤维素酶系统介导木质素物质的水解，分解纤维素，生成的主要产物为纤维素二糖和纤维素糊精。陈等人从纤维素分解群的无色杆菌属中筛选出一种新的物种，它可以产生β-葡糖苷酶。然而，为了实际调查，很少有关于这些关键属的其余酶活性的报道。
为了识别推定的功能专一的细菌群，我们计算了候选细菌属的相对丰度与对堆肥处理有显著反应的两种最具解释性酶活的变化之间的皮尔逊相关系数(Fig. 5)。只分析与酶活性显著相关的细菌属。在升温阶段，纤维素酶活性正相关与德库菌属（Desemzia）(r = 0.373;P = 0.015)、Nonomuraea (r = 0.475;P = 0.001)，而Cellulosimicrobium(r = 0.441;P = 0.003)和Vagococcus (r = 0.358;P = 0.020)与β-葡糖苷酶活性相关。在高温阶段，Nonomuraea(r = 0.558;P < 0.001)，Virgibacillus (r = 0.328;P = 0.034)， Tepidimicrobium (r = 0.420;P = 0.006)， Acidicaldus (r = 0.350;P = 0.023)的相对丰度与纤维素酶和蛋白酶活性呈显著正相关。而在腐熟阶段，Clostridium(r = 0.389;P = 0.011)， Nonomuraea(r = 0.533;P< 0.001)和Achromobacter (r = 0.347;P = 0.024)与纤维素酶和β-葡糖苷酶活性呈正相关。综上所述，我们的数据表明，升温阶段*Nonomuraea，Desemzia ，Cellulosimicrobium，高温阶段Nonomuraea和Virgibacillus以及腐熟阶段Nonomuraea, Clostridium ，Achromobacter的富集最相关与被测量的酶活性,因此在加速堆肥进程中起着至关重要的作用*。
图 5 候选细菌属相对丰度与典型酶活之间的皮尔逊相关(r)。
Pearson correlations (r) between relative abundances of candidate bacterial genera and typical enzymatic activities
皮尔森相关揭示相关微生物属和酶活的相关性.
Fig. 5. Pearson correlations (r) between relative abundances of candidate bacterial genera and typical enzymatic activities.
结论
综上所述，本研究认为，25-35初始堆肥的C/N可通过以下机制诱导高效堆肥:1)改变细菌群落组成；2)关键类群如野野村菌属、德库菌属、纤维菌属、枝芽孢菌属、梭菌属、无色杆菌属的选择和激发；3)影响可能与关键类群相关的功能酶的活性。结构方程模型(SEM)(Fig. 6)进一步表明，所鉴定的关键类群受C/N的影响，其似乎不断适应变化的微环境，从而对堆肥的成熟产生重要贡献。因此，在设计高效堆肥策略时，应考虑初始堆肥C/N的整体影响。
图 6 通过结构方程模型得到的路径图
Path diagrams obtained from structural equation modeling
结构方程模型路径图说明了C/N对堆肥成熟度的影响，是通过改变细菌群落组成和关键类群的相对丰度来改变酶活性的。采用卡方检验来评估原始相关矩阵与整体因果模型之间的适应性。箭头上的数字是标准化的路径系数(相当于相关系数)，箭头的宽度表示因果关系的强度。虚线箭头表示不显著的路径系数(P > 0.05)，红色箭头表示正相关，蓝色箭头表示负相关。(为了解释图中对颜色的引用，读者可以参考本文的web版本。)
Fig. 6. Path diagrams obtained from structural equation modeling illustrating the effects of C/N ratio on composting maturity by altering enzymatic activities as a
result of changes in bacterial community composition and the relative abundances of key taxa. The chi-square test was performed to assess the adequacy between the
original correlation matrix and the overall causal model. Numbers on arrows are standardized path coefficients (equivalent to correlation coefficients), width of the
arrows shows the strength of the causal relationship. Dotted arrows indicate non-significant path coefficients (P > 0.05) with red and blue arrows indicate positive
and negative relationships, respectively. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)
材料与方法
堆肥材料和实验设计
Compost materials and experimental design
堆肥在江苏君德农业科技有限公司进行(33°36′ N, 119°01′ E) (淮安，中国) ，堆肥原料为牛粪、蘑菇渣、锯末(Table 1)。以15(堆1)、25(堆2)、35(堆3)三种不同C/N比的料堆进行高温好氧堆肥 (Table 1)。
表1：堆肥构建中选用基质的物理化学特性(基于干重)。
堆肥处理是:1)堆1:C/N= 15; 2)堆2:C/N= 25; 3)堆3:C/N=35
初始含水率约为60%的原料混合物被排列成大的条状的料堆(长8米)，横截面呈三角形(底宽2.8米，高1.5米)。堆肥混合料在前两周每3天翻堆一次，之后每5天翻堆一次。
分别于第0、1、5、16、25、39天在5个地点采集样本。为了保证样本的代表性，每一堆被分成七个部分，在不同高度采样(下半部:5-10厘米;中间部分:50-60厘米;上面的部分:100- 20厘米)，然后混合成一个样品。取总重约1.0 kg的样品，将每个样品分成三份，一份保存于4℃，一份风干测定理化性质，另一份保存于-80℃用于后续的DNA提取。每个处理在每个时间点收集7个生物学重复，共42个样本，代表6个时间点。总共收集了三种处理共126个样本并进行后续分析。
分析方法
Analytical methods
根据Liu等人的方法，每天上午9点和下午3点记录堆肥温度。新鲜样品的含水率是通过105°C恒温烘干测定的。
新鲜样品的水提物的制备是按1:10 (w/v)的比例用水平振荡器在室温下振荡1小时，然后12000转离心10分钟,再过0.45μm滤膜制备成的。用pH电极(PB-10, Sartorius, Germany)测定新鲜提取物的pH值。铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)的浓度经由自动分析仪(Auto Analyzer 3，德国)测定。水溶性碳(WSC)采用TOC/TN分析仪(multi N/C 3000, Analytic Jena AG, Germany)测定。总碳(TC)和总氮(TN)含量经由元素分析仪(Vario EL III，德国)测定，并用于计算碳氮比。使用中国黄瓜(Cucumis sativus L.)种子根据以下公式测定发芽指数
(GI):GI(%) =种子发芽数×处理根长×100/(种子发芽数×对照根长)。半纤维素、纤维素和木质素的含量根据Van Soest的方法进行测定。中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量的差值被确定为半纤维素的含量。据此，确定ADF与酸性洗涤木素(ADL)含量的差值为纤维素含量、ADL与灰分的差值被确定为木质素含量。除温度外，所有结果均为7次重复的平均值，并以每材料干重表示。
酶活
Enzymatic activities
根据Barrena等人(2008)的方法，通过检测水合堆肥提取物处理的三苯基四唑氯铵(TTC)溶液中的三苯基福尔曼(TPF)含量来定量测定脱氢酶活性。以羧甲基纤维素为底物，测定纤维素酶活性。β-糖苷酶的活性按照Masciandaro等人的方法用基于硝基酚苷(pNPG)溶液处理的水合堆肥提取物在37℃下孵育1小时后由硝基酚释放量的比色进行估计测定。最后，基于用酪蛋白处理的水合堆肥提取物经孵育1小时(37℃)后释放的氨基酸量以及随后与Folin Ciocalteau试剂的反应来测定蛋白酶活性。
DNA的提取，PCR扩增和测序
DNA extraction, PCR amplification and sequencing
使用PowerSoil DNA提取试剂盒(MoBio Laboratories Inc., Carlsbad, USA)，根据制造商的说明从0.5g堆肥样品中提取总DNA。用核酸浓度测定仪(NanoDrop 2000, ThermoScientific,USA)测定DNA的浓度和质量(A260/ 280的比值)。
从每个堆肥样品中提取的DNA作为16S rRNA基因扩增的模板。细菌引物520F (5’ -AYT GGG YDT AAA GNG-3’)和802R (5’ -TAC NVG GGT ATC TAA TCC-3’) (Claesson 等人， 2009)用于扩增细菌16SrRNA的V4高变区。用于最终测序的引物包括合适的Illumina接头、pad连接器、基因特异性引物，以及附在反向引物上的每一个样品所特有的6-nt条形码。PCR反应和产物纯化按照之前的方案进行。PCR产物以等摩尔浓度定量汇集到最终浓度为10nm，随后在上海个人生物科技有限公司进行Illumina Miseq测序。
测序数据处理
Sequence data processing
原始数据使用FLASH V1.2.7 和 QIIME进行装配，去除接头及引物序列并基于唯一的条形码分配给每一个样品。在使用
QIIME合并分割的序列和去除低质量序列后，使用UPARSE流程、USEARCH和Perl脚本分析干净配对的序列，以生成具有代表性序列的OTU表。基于97%的序列相似性，删除了短的、模棱两可的和低质量的读长，以便进一步进行细菌群落分析。去除singleton之后，得到126个堆肥样品的总共5252554个细菌16S rRNA基因的高质量序列用于群落分析。每个样本序列的数量从24,944个到72,231个不等，平均为41,686个。样本抽平到24,944个序列后，聚类出8138个OTUs，平均覆盖率为0.928。利用RDP分类器基于RDP细菌16S rRNA基因数据库对每个OTU的代表性序列进行分类(release11.http://rdp.cme.msu.edu/misc/rel10info.jsp#release11)。
统计分析
Statistical analysis
所有统计检验在P < 0.05时均被认为具有统计学意义
。使用IBM SPSS 22.0 (SPSS Inc.， USA)软件程序进行多元方差分析(MANOVA)，以确定堆肥处理和阶段及其相互作用对酶活性的影响。如果统计量F是显著的，则使用单独的单变量分析。利用IBM SPSS 22.0 (SPSS Inc.，USA)软件程序计算细菌类群丰度与酶活性的Pearson相关系数。
使用MOTHUR(Schloss
et al., 2009)进行细菌α-和β-多样性的分析。对于α多样性，使用Chao 1指数估计丰富度，通过计算Shannon多样性指数来估计采样组合中观测到的otu数量。用基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)来计算表征堆肥处理和进程的β多样性。采用基于R (Oksanen et al.，2009)中的vegan包，以999次置换(version 3.5.1, R Core Team, 2015)进行相似性分析(ANOSIM)和置换多元方差分析(PERMANOVA)的来评估群落的相似性(Oksanen et al.，2009)。为了进一步可视化取样频率与环境变量之间的关系，利用RDA函数进行了冗余分析。采用R中vegan包里的envfit函数经过999置换对环境因子进行排序，选择P < 0.01的变量作为自变量。线性判别分析效应(LefSe)以至少3.5的LDA值来鉴定特异细菌分类学特征(Segata et al.， 2011)。这表明了不同堆肥阶段的三种处理在属水平上差异丰富的类群。通过R中的sem，vegan，dplyr，DiagrammeR，和semPlot包采用结构方程模型来验证假定的关键菌种组合、细菌群落组成、酶活性和堆肥腐熟度对堆肥各阶段直接和间接的影响(升温期:
χ2 = 33.018,P = 0.203;高温期:χ2 = 28.542,P = 0.127和腐熟期:χ2 = 26.629,P = 0.105)。在此，该模型是基于先前的研究，用于确定关键物种群体，细菌群落组成，酶活性和堆肥腐熟度等变量的分配。
序列登录号
Sequence accession numbers
所有原始序列数据都可以在NCBI Sequence Read Archive(SRA)数据库中找到，序列登录号为PRJNA528191。
毕业寄语
乔策策，南京农业大学博士，师从著名土肥专家沈其荣教授，读博期间到美国亚利桑那州立大学学习一年，师从C. Ryan Penton教授。作为我的舍友师兄，日前已经顺利完成博士论文答辩，即将开启新的征程，可谓是人生赢家（就不详述了），在此祝愿师兄前程似锦，再接再厉，多发好文章，芝麻开花节节高。
编译：马腾飞 南京农业大学
责编：文涛 南京农业大学
审核：刘永鑫 中科院遗传发育所
Reference
Cece Qiao,C. Ryan Penton,Chao Liu,Zongzhuan Shen,Yannan Ou,Zhengyang Liu,Xu Xu,Rong Li,Qirong Shen. Key extracellular enzymes triggered high-efficiency composting associated
with bacterial community succession.Bioresource Technology 288 (2019) 121576 doi:10.1016/j.biortech.2019.121576
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