让国自然搭上诺奖的快车！nature重磅揭示全新的组蛋白表观遗传学修饰机制，只知道甲基化、磷酸化、泛素化？你out啦！
细胞的氧代谢是最近热门的科学话题，2019年诺贝尔生理学或医学奖就颁给了发现了“细胞如何感知和适应氧气供应”的三位科学家，而氧气与体内的代谢过程关联紧密，特别是在肿瘤代谢组学的研究中，缺氧应激状态等导致的代谢紊乱往往促使肿瘤的发生发展，继而引起下游表观遗传学的改变，后者也是近几年研究的焦点，甲基化、磷酸化、泛素化相信大家不会陌生，但近期在Nature上一篇文章则提出了一种闻所未闻的乳酸化修饰。美国芝加哥大学的华人科学家赵英明教授课题组揭示了一种全新的组蛋白表观遗传学修饰机制【1】，将细胞氧气供应、肿瘤代谢、表观遗传几个热点紧密相连，为小伙伴们即将到来的国自然奋斗季提供了新思路。同期Luke T.Izzo与 Kathryn E. Wellen也发表了评论【2】。
下面笔者将结合Nature点评，和大家一起快速领略文章思路：
一、速览背景
细胞代谢需要氧气的参与以及各种糖类作为底物，其中无氧糖酵解则产生大量的乳酸。在肿瘤细胞中有沃伯格效应（Warburg effect）【3】，即肿瘤细胞在富含氧气的条件下仍然选择效率较低的无氧酵解方式，产生大量乳酸。赵英明教授团队报道了一种全新的组蛋白乳酸化修饰，影响下游基因的表达、DNA的复制与修复等过程。他们认为组蛋白可被乳酰基基团修饰，导致功能改变。
二、如何证明乳酸化修饰
1. 质谱技术：分析组蛋白尾端氨基酸残基的质量偏移；对比化学合成的肽段与细胞内修饰肽段质谱图，验证乳酸化存在。
为了验证组蛋白中赖氨酸乳酸化的存在，作者首先使用了4个组蛋白正交方法。在前两种方法中，使用HPLC -MS/MS分析来比较合成的肽与其来源于活肽的对应物，以确定这两种肽在HPLC色谱洗脱方面是否具有相同的化学性质以及MS/MS分析中的裂解规律。为了实现这一目标，作者生成了三种带有Kla修饰的组蛋白肽：H3K23-QLATKlaAAR; H2BK5-PELAKlaSAPAPK 和 H4K8-GGKlaGLGK。每对肽在高效液相色谱中共洗脱，其MS/MS具有可比性 (图1b)。随后的质谱分析分别从人类HeLa细胞和小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)中鉴定出26个和16个组蛋白Kla位点(图1c)。
（图1：蛋白Kla的鉴定与验证。a、Kla结构示意图。b，从MCF-7细胞中提取的组蛋白肽(H3K23la)的MS/MS谱，其合成物及其混合物。b离子是肽的n端，y离子是肽的c端。数据代表两个独立的实验。c，组蛋白Kla位点在人类和小鼠细胞中识别的例证。）
2. 同位素标记：稳定同位素13C标记葡萄糖，证明乳酸参与组蛋白修饰过程。
作者将MCF-7和其他细胞系暴露于不同浓度的葡萄糖中，葡萄糖是细胞内乳酸的主要来源。乳酸产生和组蛋白Kla水平均由葡萄糖以剂量依赖的方式诱导(图2a、b)。相反，不可代谢的葡萄糖类似物2-deoxy-d-glucose(2-DG)降低了乳酸的产生和组蛋白Kla水平(图2c,d)。使用同位素葡萄糖代谢标记实验(U-13C6)其次是MS / MS分析表明赖氨酸乳酸化来自葡萄糖。
（图2：乳酸调节组蛋白Kla。）
3. 细胞实验：增加细胞内乳酸的剂量时，赖氨酸乳酸化水平也升高了。（同第三部分）
三、糖酵解过程
有氧条件下细胞在线粒体进行三羧酸循环，并产生乙酰辅酶A等中间体。肿瘤细胞糖酵解过程中会产生乳酸，葡萄糖分解为两个丙酮酸，产生乳酸等代谢产物。在缺氧或低氧条件下，乳酸的产量会增加。乳酸的产生取决于糖酵解和线粒体代谢的平衡。作者测试了这些活动是否这两种途径中的酶可以调节乳酸水平，进而调节组蛋白Kla(图2e)。通过调节丙酮酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的活性，用二氯乙酸钠 (DCA)和草酸酯可抑制乳酸的产生，这两种化合物降低了细胞内乳酸盐的水平(图2f)，组蛋白Kla的水平(图2g, h)以及细胞内乳酸和组蛋白Kla水平(图2f, i)。结果表明，赖氨酸的乳酸化在糖酵解产生的乳酸增多时会升高。
（图2：乳酸调节组蛋白Kla。）
四、乳酸化的生物学功能实验
作者观察了巨噬细胞（诱发炎症M1型和抑制炎症M2型两种）。使用细菌或脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞向M1分化。发现随着糖酵解增加，胞内乳酸的水平也会逐渐升高，同时组蛋白的乳酸化水平也升高。
图3
已经有证据表明，乳酸在先天免疫细胞和适应性免疫细胞中都具有调节功能，并能引起基因表达的显著变化，这表明乳酸并不仅仅是糖酵解的“废物”。促炎性M1巨噬细胞的代谢重新编程，向需氧糖酵解方向发展，而抗炎的M2巨噬细胞则启动了一个增加氧化磷酸化和脂肪酸氧化的代谢程序。作者对组蛋白Kla标记及其动力学的发现提示了在M1巨噬细胞极化过程中调节基因表达的作用。
首先，作者先测定了M1巨噬细胞极化过程中组蛋白Kla增加与哪些基因的激活有关，用LPS和IFNγ处理后的乳酸生产和M1巨噬细胞极化中组蛋白kla，观察到M1激活后16-24小时内细胞内乳酸水平升高(图4a)，这与组蛋白Kla水平升高相关(图4b, c)。乳酸产量的增加和组蛋白Kla也是M1巨噬细胞特有的，因为它们在m2极化的巨噬细胞中未观察到(图4d)，它们更依赖于脂肪酸氧化。此外，H3K18la增加(2倍增加)明显多于H3K18la减少(2倍减少)，而H3K18ac修饰则相反(图4e)。与LPS处理相似，细菌诱导的乳酸产生和整体组蛋白Kla，而不是组蛋白Kac水平(图4i)，以及早期细胞因子和晚期Arg1表达的动力学被维持(图4j)。精氨酸代谢是巨噬细胞极化过程中一个关键的分解和合成代谢过程。M1巨噬细胞被认为是低水平的ARG1和代谢精氨酸通过一氧化氮合酶产生一氧化氮杀死病原体，而M2巨噬细胞有高水平的ARG1，产生鸟氨酸促进伤口愈合。与他们的RNA动力学一致，在M1极化后24-48小时，ARG1蛋白水平和活性显著增加，而NOS2蛋白水平和功能在M1极化后12小时达到峰值，并在随后的时间点下降(图4k)。这些结果都表明，在LPS刺激时，与M1特性相关的炎症基因表达迅速上调，赖氨酸乳酸化增加与参与维持稳态的基因上调相关（同图3b）。
图4: M1巨噬细胞极化过程中组蛋白Kla增加与m2样基因激活相关。
在M1极化过程中，缺乏LDHA（乳酸脱氢酶）的巨噬细胞乳酸产量和整体组蛋白Kla水平均下降(图5a, b)。在巨噬细胞中敲除LDHA会减弱Arg1并降低Arg1启动子的组蛋白Kla标记(图5c, d)。接下来，作者通过外源性乳酸处理M1巨噬细胞来增加乳酸水平。外源性乳酸增加细胞内乳酸(图5e)和组蛋白Kla水平(图5f)，并诱导Arg1启动子Arg1表达(图5g)和Kla水平(图5h)。这些结果都表明乳酸通过组蛋白Kla激活m2样基因表达。不能产生乳酸的巨噬细胞可以在受到LPS刺激时增加炎症基因的表达，但无法上调赖氨酸乳酸化或者相关稳态基因的表达【2】。
图5: 乳酸通过组蛋白Kla激活m2样基因表达。
根据上述的结果作者提出了一种延迟的“乳酸计时器”模型：组蛋白乳酸化促进了涉及解决感染所需基因的激活，从而帮助组织重归稳态【2】。
五、乳酸化修饰的特点
体外反应：作者证明乳酰辅酶A为赖氨酸的乳酸化提供了酰基，同时乙酰转移酶p300可以促进乳酰辅酶A的酰基基团向组蛋白转移。
六、总结思考
1. 大佬为何能发Nature?
提出超前的观点，揭露了从未有过的乳酸化表观遗传修饰。
多方合作，数据量大，逻辑紧密，让人信服。本文通讯作者单位均依托芝加哥大学的Ben May癌症研究中心，集结了中、美、韩的学术力量。
虽没有详细的机制研究，但创新性足以上CNS，科研热点讲究一个字——快。
2. 如何结合自己的国自然课题？
在肿瘤代谢、细胞免疫方面，可以延伸思考自己要研究的基因或蛋白质有无类似表观遗传修饰的可能性
权衡实验条件和经费，证明乳酸化存在的质谱法与示踪法都有点烧钱。
细胞功能试验能否加入氧调节相关的因素如无氧条件或缺氧条件，检测下游乳酸化水平的变化。
祝大家都能坐上诺奖的快车，走在国自然的前沿！
参考文献：
【1】Zhang, D., Tang, Z., Huang, H. et al. Metabolic regulation of geneexpression by histone lactylation. Nature 574, 575–580 (2019)doi:10.1038/s41586-019-1678-1（https://www.nature.com/articles/s41586-019-1678-1）
【2】Nature 574, 492-493 (2019) doi: 10.1038/d41586-019-03122-1 （https://www.nature.com/articles/d41586-019-03122-1）
【3】Guarente L: The Many Faces of Sirtuins: Sirtuins and the Warburg effect.Nature Medicine 2014, 20:24.
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