PNAS | 茅毓新组发现非典型去泛素化酶

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撰文 | 万敏

泛素化是真核生物中常见的翻译后蛋白质修饰，对于一些列细胞活动有非常重要的意义。传统的泛素化途径涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应。噬肺军团菌感染宿主细胞过程中，通过分泌不同类型的E3泛素连接酶劫持宿主细胞内的泛素化途径，进而修饰特定的宿主蛋白，为含军团菌液泡（LCV）的成熟提供条件。据统计，在噬肺军团菌分泌的300多个效应蛋白中，有17个可能具有E3 连接酶功能，另外有6个具有去泛素酶（Deubiquitinase, DUB）活性。

然而，噬肺军团菌的“军营”里面不光有战斗力惊人的“常规战士”，也有一些依靠“神奇魔力”而笑傲江湖的“魔法师”。2016年美国普渡大学的罗招庆实验室做出了有里程碑意义的研究发现：SidE家族蛋白可以催化一种不依赖E1,E2和ATP的非经典泛素化途径【1】。SidE家族的单ADP-核糖转移酶（mART）结构域可以通过消耗一分子的NAD, 对泛素分子的精氨酸（Arg42）位点进行ADP-核糖基化修饰生成ADPR-Ub。同年，德国歌德大学Ivan Dikic 实验室在Cell杂志上阐明了SidE家族的磷酸二酯酶（PDE）结构域可以催化剪切ADPR-Ub的焦磷酸键，将ADPR-Ub分子中的磷酸核糖-泛素（PR-Ub）转移连接到底物的丝氨酸上【2】。这种通过磷酸酯键连接PR-Ub和底物的非经典泛素化被称作磷酸核糖泛素化（图1）。之后在2018年5月，多家实验室通过结构生物学等手段进行了深入研究SidE家族的mART和PDE结构域的详细作用机理，其中包括包括中国科学院生物物理所的高璞组（Cell丨高璞组揭示新型泛素化修饰的作用机制——胡荣贵、王丰点评）【3】，北京化工大学的冯越组（Nature | 北化工冯越组揭示新型泛素化反应的分子机制）【4】，美国康奈大学茅毓新组【5】以及德国的Ivan Dikic组【6】。

关于逆转转由磷酸核糖连接的泛素化，此前2017年5月12日，罗招庆课题组在Cell Research上报道了一种由嗜肺军团菌编码的效应蛋白具有独特的去泛素化酶SidJ的功能，可逆转由磷酸核糖连接的泛素化（吉林大学罗招庆组揭示独特的细菌去泛素化酶可逆转磷酸核糖连接的泛素化——附专家点评），近期罗招庆课题组与欧阳松应课题组合作详细解析了SidJ调控SidE酶活性的分子机制，为探讨谷氨酸修饰酶的催化机制提供了新的体系（专家点评Nature | 罗招庆/欧阳松应合作解析一种谷氨酸化修饰的新机制）。此外，其它课题组近期有报道了类似的结果【8-11】。

图1. SidE家族蛋白催化磷酸核糖基泛素化的两步反应示意图

噬肺军团菌可不是普通的盗匪，他们不仅擅长使用进攻武器攻城拔寨，更懂得如何有效合理地回收利用资源，保证长期发展。噬肺军团菌效应蛋白介导的一些蛋白质修饰（如单磷酸腺苷化、磷酸胆碱化等），往往存在与之相对应的反作用反应（counteractive reactions）来移除这些修饰。那么是否存在与磷酸核糖泛素化相对应的其它去泛素化途径呢？

2019年11月5日，美国康奈尔大学的茅毓新实验室在PNAS发表了文章Deubiquitination of phosphoribosyl-ubiquitin conjugates by phosphodiesterase-domain–containing Legionella effectors（万敏和Alan Sulpizio是文章的共同第一作者）。该文通过生物化学、质谱（LC-MS/MS）、细胞以及细菌感染等实验手段首次证明了噬肺军团菌分泌蛋白DupA（lpg2154）和DupB（lpg2155）是针对磷酸核糖泛素化途径的去泛素化酶。

SidE家族的4个高度同源的蛋白都含有mART和PDE结构域。通过软件预测，研究人员发现有5个效应蛋白也含有PDE结构域，但不含有mART结构域（图2）。那么这些未被鉴定的PDE结构域他们是否具有类似于SdeA蛋白的PDE结构域的类似功能呢？

图2. （A）噬肺军团菌效应蛋白SdeA, DupA, DupB的结构域示意图。（B）DupB PDE H67A-ADPR-Ub的复合物结构显示DupB的催化位点His67靠近ADPR-Ub的beta-磷酸部分，表明了DupB对 ADPR-Ub 的水解是His67对焦磷酸键进行攻击所导致。

研究人员通过大肠杆菌重组表达了所有的PDE结构域，发现，同SdeA一样，DupA和DupB的PDE结构域也可以剪切ADPR-Ub中的焦磷酸键生成PR-Ub。但是与SdeA PDE的ADPR-Ub ligase的功能不同，DupA和DupB的PDE具有完全相反的DUB功能：它们可以高效地切除连接在Rab33b分子上的PR-Ub（图3A）。研究人员用Pro-Q Diamond phosphoprotein stain方法检测出DupA/B与Rab33b-PR-Ub反应后有大量的游离PR-Ub生成，该结果之后通过质谱检测得到证实。DupA/B的DUB功能的本质是：催化位点His67攻击PR-Ub磷酸基团与底物丝氨酸之间的磷酸酯键所致（图3C）。基于in vitro实验的结果，研究人员也做了细胞毒性实验。研究人员发现了DupA和DupB可以高效地回复SdeA过表达产生的细胞毒性：大量蛋白质PR-Ub修饰引起的Hela细胞的高尔基体碎片化（Golgi fragmentation）。更进一步，作者们研究了DupA/B在噬肺军团菌感染Hek293T细胞的生理条件下，发现了DupA/B的DUB功能对于负调控Rab33b的PR-Ubiquitination起着至关重要的作用（图3B）。

图3. DupA/B的PDE结构域具有PR-Ubiquitination特异性的去泛素化功能。（A）大肠杆菌纯化的重组蛋白DupA和DupB的PDE可以移除连接在底物上的的PR-Ub标签。（B）使用双敲除DupA /B的噬肺军团菌感染Hek293T细胞，可以大幅增强底物的磷酸核糖泛素化水平。（C）DupA/B工作原理的分子结构图。

从多方面证实DupA/B是PR-Ubiquitination特异性的去泛素化酶后，研究人员另外又做了大量工作来寻找新的PR-Ubiquitination底物。利用DupA/B双敲除的噬肺军团菌株并结合质谱技术，成功筛选出了一系列潜在的底物，如：Rtn4（与文献报道【7】一致）、Grasp55、LULL1等。通过实验作者们证实了Grasp55和LULL1是SidE家族的底物。研究人员鉴定的这些蛋白大多数位于ER/Golgi，一些蛋白是真核生物ubiquitin途径中的重要成员，也有一些蛋白对于ER/Golgi的细胞器形态维持和膜运输起着关键的作用。

图4. 噬肺军团菌感染宿主过程中的磷酸核糖基泛素化和去泛素化通路。

几个月前有多篇权威期刊报道了新型谷氨酸修饰酶SidJ可以修饰SidE家族蛋白并抑制它们的活性【8-11】。综合这些研究和作者们最新的结果，得出了到目前为止最完整的PR-ubiquitination和deubiquitination调节通路（图4）。相信这一研究结果将会积极推进我们对PR-ubiquitination功能的深入探索，例如（1）蛋白质的PR-ubiquitination对于LCV的生物形成的调控机制；（2）SidEs, SidJ, DupA/B对于(de)PR-ubiquitination的时间空间上的调控；（3）PR-ubiquitination是否存在于其它物种（特别是真核生物）。

原文链接：

https://www.pnas.org/content/early/2019/11/04/1916287116

制版人：珂

参考文献

1. Qiu, J., Sheedlo M.J., Tan Y., Nakayasu E.S., Das C., Liu X., Luo Z.Q. Ubiquitination independent of E1 and E2 enzymes by bacterial effectors. Nature, 2016. 533(7601): p. 120-4.

2. Bhogaraju, S., Kalayil, S., Liu, Y., Bonn, F., Colby, T., Matic, I., and Dikic, I. Phosphoribosylation of Ubiquitin Promotes Serine Ubiquitination and Impairs Conventional Ubiquitination. Cell, 2016. 167, 1636-1649 e1613.

3. Wang, Y., Shi, M., Feng, H., Zhu, Y., Liu, S., Gao, A., and Gao, P. Structural Insights into Non-canonical Ubiquitination Catalyzed by SidE. Cell, 2018.173, 1231-1243 e1216.

4. Dong, Y., Mu, Y., Xie, Y., Zhang, Y., Han, Y., Zhou, Y., Wang, W., Liu, Z., Wu, M., Wang, H., et al. Structural basis of ubiquitin modification by the Legionella effector SdeA. Nature, 2018. 557, 674-678.

5. Akturk, A., Wasilko, D.J., Wu, X., Liu, Y., Zhang, Y., Qiu, J., Luo, Z.Q., Reiter, K.H., Brzovic, P.S., Klevit, R.E., Mao Y. Mechanism of phosphoribosyl-ubiquitination mediated by a single Legionella effector. Nature, 2018. 557, 729-733.

6. Kalayil, S., Bhogaraju, S., Bonn, F., Shin, D., Liu, Y., Gan, N., Basquin, J., Grumati, P., Luo, Z.Q., and Dikic, I. Insights into catalysis and function of phosphoribosyl-linked serine ubiquitination. Nature, 2018. 557, 734-738.

7. Kotewicz, K. M., Ramabhadran, V., Sjoblom, N., Vogel, J. P., Haenssler, E., Zhang, M. Y., et al. A single legionella effector catalyzes a multistep ubiquitination pathway to rearrange tubular endoplasmic reticulum for replication. Cell Host Microbe, 2017. 21, 169–181. doi: 10.1016/j.chom.2016.12.007

8. Black, M.H., Osinski A., Gradowski M.,Servage K.A., Pawlowski K., Tomchick D.R., Tagliabracci V.S., Bacterial pseudokinase catalyzes protein polyglutamylation to inhibit the SidE-family ubiquitin ligases. Science, 2019. 364(6442): p. 787-792.

9. Bhogaraju, S., Bonn F., Mukherjee R., Adams M., Pflederer M.M., Galej W.P., Matkovic V., Lopez-Mosqueda J., et al., Inhibition of bacterial ubiquitin ligases by SidJ-calmodulin-catalysed glutamylation. Nature, 2019. Aug;572(7769):382-386.

10. Gan, N., Zhen X., Liu Y., Xu X., He C., Qiu J., Liu Y., Fujimoto G.M., et al., Regulation of phosphoribosyl ubiquitination by a calmodulin-dependent glutamylase. Nature, 2019. Aug;572(7769):387-391.

11. Sulpizio, A., Minelli M.E., Wan M., Burrowes P.D., Wu X., Sanford E.J., Shin J.H., Williams B.C., Goldberg M.L., Smolka M.B., Mao Y., Protein polyglutamylation catalyzed by the bacterial Calmodulin-dependent pseudokinase SidJ. Elife. 2019 Nov 4;8. pii: e51162.

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