国家纳米中心聂广军等ACS Nano：耗竭谷胱甘肽以恢复顺铂化学敏感性
以下文章来源于NanoLabs ，作者NanoLabs
科学，需要一点好奇心~
第一作者：徐莹、韩雪祥
通讯作者：聂广军、李一叶、包永平
通讯单位：国家纳米中心、东安格利亚大学
研究亮点：
1. 提出利用萝卜硫素衍生的天然化合物耗竭谷胱甘肽，提高癌细胞化疗敏感性
2. 设计优先释放SFN以先降低谷胱甘肽，减少CDDP泵出，从而显著增加DNA与Pt结合，并导致DNA损伤和细胞凋亡
3. 阐明了SFN-CDDP-NPs的细胞凋亡机制
研究背景：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因。抗癌药顺铂（CDDP）在临床上广泛用于单独治疗或与其他治疗方法结合使用对抗乳腺癌和其他人类癌症。然而，CDDP在全身性给药后会不加区别地破坏肿瘤细胞和正常细胞，并表现出剂量限制性副作用，例如急性肾毒性和肝毒性，这在很大程度上限制了其临床用途。
在过去的二十年中，启用纳米颗粒（NPs）的药物递送系统大大提高了基于Pt的化学疗法。例如长循环脂质体，水溶性聚合物和聚合胶束，NPs已被广泛用于促进CDDP传递至作用部位。迄今为止，聚（l -谷氨酸）是最成功的CDDP载体。特别是，聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物在通过羧基与CDDP配位，可以形成聚合物胶束（由Nanocarriers开发的NC-6004）。已在日本和其他亚洲国家/地区进行了III期临床试验。尽管已证明NC-6004和其他纳米制剂可显着降低CDDP的全身毒性，但治疗效果并未得到明显改善。
基于Pt的化学疗法的抗肿瘤效果不理想的最重要原因之一是由于含巯基物质的水平升高而导致CDDP的胞质解毒。谷胱甘肽（GSH）可以与Pt结合形成Pt（GS）2共轭物，然后通过ATP依赖的谷胱甘肽S共轭输出泵（GS-X）从肿瘤细胞迅速泵出。大量研究证明，通过降低GSH的细胞浓度，可以大大恢复癌细胞对CDDP的化学敏感性。萝卜硫烷（SFN）是西兰花中一种天然异硫氰酸酯，以其预防癌症作用而闻名，其机制涉及多种靶向作用。考虑到上述GSH含量与肿瘤化学敏感性之间的负相关关系，可假设通过SFN介导的GSH耗竭可以显着提高纳米级CDDP的治疗效果，但迄今为止尚未探索。
成果简介：
有鉴于此，国家纳米中心聂广军研究员与李一叶研究员联合东安格利亚大学包永平教授报道了一种由水溶性聚（γ,l -谷氨酸）-CDDP共轭物（γ-PGA-CDDP）和SFN组成共递送纳米颗粒，用于乳腺癌治疗。用两亲性共聚物mPEG-PLGA制备包封两种药物的NPs（SFN-CDDP-NP），γ-PGA-CDDP和SFN分别被封装在亲水核和疏水壳中，这可以同时将疏水性和亲水性药物递送至癌细胞。并对SFN-CDDP-NPs的治疗功效进行了系统的研究。
图1. 用于改善抗肿瘤治疗的SFN-CDDP-NP的制备示意图
要点1：SFN-CDDP-NPs的合成与表征
研究人员采用改良的双乳化方法制备SFN和γ-PGA-CDDP负载的mPEG-PLGA纳米颗粒（SFN-CDDP-NPs）。在优化的SFN-CDDP-NP中，SFN和CDDP的封装效率分别为58.7±4.5％和92.6±3.6％。SFN-CDDP-NPs的水合直径约为98.2 nm，ζ电位的-15.4 mV，这有助于长期血液循环和被动靶向肿瘤。此外，SFN-CDDP-NPs在37℃孵育3天后显示出良好的胶体稳定性并保持了结构完整性。在药物释放方面，SFN从SFN-CDDP-NP中释放的速度比CDDP更快，这有利于降低细胞内GSH并防止CDDP失活。
图2. SFN-CDDP-NPs的合成与表征
要点2：NPs的细胞摄取和细胞内定位
为揭示NPs的细胞摄取行为，研究人员使用若丹明B标记mPEG-PLGA NPs（RhoB-NPs）。通过共聚焦激光扫描显微镜观察。游离的RhoB和RhoB-NP均显示出时间依赖性的细胞摄取。在处理后1小时，RhoB-NPs主要通过内吞作用被内在化并进入溶酶体。在6小时后，大量的红色荧光与绿色荧光分开，表明它们从溶酶体转运到细胞质。通过使用流式细胞仪进行定量分析，进一步证实了NPs增强细胞内在化。
图3. NPs的细胞摄取和细胞内定位
要点3. 体外细胞毒性
研究人员接着使用CCK-8测定不同制剂的细胞毒性。mPEG-PLGA纳米颗粒在高达800 ug/mL浓度都没有明显的细胞毒性。在药物治疗结果显示，SFN-CDDP-NPs具有最显著的细胞毒性，且促使细胞凋亡达64.6％。
大量研究表明，CDDP介导的DNA损伤可以激活p53并进一步触发p53介导的细胞凋亡以及PARP裂解介导的细胞分解。因此，研究人员对细胞凋亡机制相关蛋白进行研究，结果显示SFN-CDDP-NPs导致γ-H2AX，p53和裂解的PARP发生最显著的上调，且显著减少Bcl-2表达。这些结果阐明了SFN-CDDP-NPs的细胞凋亡机制。
图4. 体外细胞毒性结果
要点4. GSH的耗竭增加Pt–DNA复合物
GSH在CDDP解毒中起着至关重要的作用，而GSH的耗竭被认为会增加Pt-DNA加合物的形成和化学敏感性。为了研究SFN介导的谷胱甘肽耗竭的功效，研究人员在治疗后测量了细胞谷胱甘肽和DNA结合的铂。结果表明，与游离SFN和SFN + CDDP相比，SFN-CDDP-NPs显著降低MCF-7细胞中的GSH含量，且与DNA结合Pt的水平最高，从而导致最显着的细胞细胞毒性。总之，这些结果表明，GSH的强烈耗竭对于Pt-DNA加合物形成的增加是必不可少的，这说明SFN-CDDP-NP在体外具有优越的治疗功效。
图5. SFN-CDDP-NPs诱导细胞凋亡的机理分析
要点5. 抗肿瘤效果
为了揭示NP的药代动力学和生物分布，研究人员制备了吲哚花青绿色标记的mPEG-PLGA NP（ICG-NP），其理化性质与SFN-CDDP-NP相似。结果表明，SFN-CDDP-NP与游离药物相比，可以维持较高的有效药物浓度并维持更长的治疗时间。
接着，在原位乳腺肿瘤模型中研究了SFN-CDDP-NP的治疗效果。与体外结果不同，SFN几乎没有增强CDDP的抗肿瘤作用，这很可能是由于小分子的快速消除。相反，SFN-CDDP-NPs组的肿瘤生长受到更明显的抑制，肿瘤抑制率更高，为74.1％。因此，SFN-CDDP-NPs优异的抗肿瘤作用主要归因于通过NPs介导被动靶向导致CDDP积累和基于SFN的GSH耗竭导致的DNA-Pt复合物显着增加。
图6. 抗肿瘤效果
小结：
综上所述，SFN-CDDP-NPs为提高基于Pt的化疗的敏感性和治疗效果提供了一种简单而强大的策略。
参考文献：
Xu, Y.; Han, X.; Li, Y.; Min, H.; Zhao, X.; Zhang, Y.; Qi, Y.; Shi, J.; Qi, S.; Bao, Y.; Nie, G., Sulforaphane Mediates Glutathione Depletion via Polymeric Nanoparticles to Restore Cisplatin Chemosensitivity. ACS Nano 2019.
https://doi.org/10.1021/acsnano.9b07032
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